灭活剂、保护剂和免疫佐剂

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1、第三章灭活剂、保护剂和免疫佐剂第一节灭活剂一、灭活与灭活剂1、灭活概念是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。微生物毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性灭活2、灭活方法物理方法（不用）化学方法（常用）3、灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂二、常用灭活剂的灭活机理与应用(一)灭活剂种类1、甲醛溶液：①蛋白质②核酸烷基化（不加中断剂）2、烷化剂乙酰基乙烯亚胺（AEI）二乙烯亚胺(BEI)缩水甘油醛（

2、使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫代硫酸钠中断灭活）3、苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制4、结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原5、β-丙酰内酯病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用.注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤粘膜有强烈刺激性如：甲醛、β-丙酰内酯甲醛溶液：《规程》（2000）中的26种灭活疫苗灭活机理：灭活浓度：多数为0.1％～0.3％灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的；必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。氨基甲基胺羧基亚甲基二醇单酯巯基亚甲基二醇甲醛醛基羟基羟基甲酚烷化剂（al

3、kylatingagent）乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI)、缩水甘油醛灭活机制：1.烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。2.与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetylethylenimine，AEI）淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年AEI功能基团是乙烯亚

4、胺基，可用于口蹄疫灭活苗。口蹄疫病毒液:终浓度0.05％，30℃8h,加2％硫代硫酸钠阻断2、二乙烯亚胺（binaryethylenimine，BEI）市购商品为0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1个月;终浓度0.02%,加入2％硫代硫酸钠中断灭活。3、缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA）大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/ml。0～4℃3个月含量渐下降，约半年失效；20℃只能保存10d。4、-丙酰内酯（－propiolactone）又名羟基丙酸--内酯无色有刺激气味的液

5、体，水溶液应密封于玻璃瓶中5℃保存水中溶解度37％，能与丙酮、醚和氯仿任意混合对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。病毒灭活后，能保持良好的免疫原性主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。三、影响灭活作用的因素1、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛最常用。2、微生物种类和特性3、灭活剂浓度（一定要适合）4、灭活温度（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和温度不一致）5、灭活时间6、灭活PH值7、有机物存在第二节保护剂（稳定剂）保护剂：又称稳定剂（stabilizer），是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、

6、血清制备等）保护剂用途（不同用途加不同保护剂,主要针对活的微生物或细胞）①菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂②细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO)DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂③疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖保护剂（protector）的分类分类：（根据其作用机理）——渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等——非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等（根据其分子量大小）——高分子物质、低分子物质。（按其化学性质）——复合物、糖类、盐类、醇

7、类、酸类和聚合物复合物脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等糖类蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等盐类乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等醇类山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸类柠檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等一些常用的冷冻干燥保护剂分类保护剂疫苗冻干保护剂组成1.营养液：可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，增加溶解度2.赋形剂：防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响使冻干制品形成多孔

8、性、疏松的海绵状物，增加溶解度3.抗氧化剂：抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。①防