实时荧光定量PCR检测造血干细胞移植后患者外周血TREC的方法研究

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1、第一军医大学硕士学位论文实时荧光定量PCR检测造血干细胞移植后患者外周血TREC的方法研究姓名：阴继霞申请学位级别：硕士专业：实验血液学指导教师：孙竞20030606英文缩写TRECFQ—PCRallo．HSCTauto．HSCTPBSCTBMTFCM同丌CAPCMHCDNAdNTPTaqMNCEDTAGVHDPBLTCRSDSnsbp缩略名词中英文注释英文全称T-cellreceptorexcisioncirclesFluorescentQuantitativePCRallogeneichematopoieticstemc

2、elltransplantationautogeneichematopoieticstemcelltransplantationperipheralbloodstemcelltransplantationbonemarrowtransplantationFlowcytometryFluorescein-isothiocyanateAntigenpresentcellmajorhistocompatibilitycomplexdeoxyribonucleicaciddeoxynucleosidetriphosphateTher

3、musaguaticusmononuclearcellethylenediaminetetraa-ceticacidgraftversushostdiseaseperipheralbloodlymphocytesTcellreceptorsodiumdodecylsulfatetrishydroxymethylaminome·thanebasepair中文全称T细胞受体删除环荧光定量PCR异体造血干细胞移植自体造血干细胞移植外周血干细胞移植骨髓移植流式细胞仪异硫氰酸荧光素抗原提呈细胞主要组织相容性复合体脱氧核糖核酸脱氧三磷酸

4、核苷水生栖热菌单个核细胞乙二胺四乙酸移植物抗宿主病外周血淋巴细胞T细胞抗原受体十二烷基硫酸钠三羟甲基氨基甲烷碱基对实时荧光定量PCR检测造血干细胞移植后患者外周血TREC的方法研究中文摘要目的胸腺近期输出的初始T细胞(naiveTcell)数量可作为机体T细胞增殖能力和胸腺再生输出功能的评价指标。以往多是应用CD45的同功异构体区分新近生成的初始T细胞(CD45RA+)和记忆T细胞(CD45RO+)来研究胸腺再生输出能力及在造血干细胞移植(HSCT)后免疫重建过程中的作用，但近年的研究显示CD45RA+细胞的含量并不能完全准

5、确地代表胸腺功能。近期研究表明，TCRa键基因重排时形成的T细胞受体删除DNA环(TREC)或称信号结合T细胞受体删除环(sjTRECs)是初始T细胞的标志，可作为胸腺再生输出功能的指标。目前国内尚未见有关造血干细胞移植后TREC研究的报道。为了解移植之后患者的胸腺再生输出功能与相关的免疫功能重建机制，本课题拟研究摸索建立检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR(FQ．PCR)的方法及实验影响条件，并以看家基因l乙AG2为参比对照确定细胞数，从而更准确定量TREC的拷贝数，为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建

6、机制提供了方法学基础。方法分别比较用UNIQ．10柱式基因组DNA抽提试剂盒与酚氯仿抽提两种方法提取外周血有核细胞的基因组DNA，以用于PCR模板。以NCBI核酸数据库的TREC和看家基因RAG2参照序列为靶序列，应用PCR．Express软件设计分别特异于TREC和RAG2序列的TaqMan—MGB荧光探针及多种引物，其中看家基因RAG2用于参比对照(每个细胞含2拷贝RAG2，因此RAG2的拷贝数可间接反映外周血的有核细胞数)。分别研究分析金牌Taq酶和普通Taq酶等多个扩增体系影响因素，在ABl7000PCR仪上实时扩增

7、检测构建的TREC质粒2标准品，摸索最佳扩增条件及建立标准曲线，然后用优化的FQ．PCR方法检测临床样本，计算1000个细胞所含的TREC的拷贝数。临床样本收集来自南方医院的49例造血干细胞移植病人的移植前、移植之后15天、30天、90天和180天等五个不同时间点的90份肝素抗凝外周血标本。应用SPSSIO．0软件统计分析所得数据。结果采用UNIQ．10柱式基因组DNA抽提试剂盒提取外周血有核细胞的基因组DNA，比较酚氯仿抽提法得到的DNA含量高，纯度好，扩增效率好。FQ-PCR检测TREC的方法建立：以TREe标准品【浓度

8、梯度分别为：lxl07，lxl06，lxl05，lxl04，lxl03，lxl02，20和10／100ugDNA(2u1)为阳性对照，看家基因RAG2作为参比对照，通过定量细胞数检测TREC拷贝数。以标准品为模板，在相同反应条件下，摸索FQ．PeR的最佳反应体系，结果发现：1．在相同反应条