高压CO2对胃癌细胞侵袭能力的影响

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1、高压CO2对胃癌细胞侵袭能力的影响作者：倪生许辉任凤铭任武军【摘要】目的：探讨CO2对胃癌细胞腹腔转移能力的影响。方法：体外培养高侵袭力人胃癌MKN45细胞株，高压CO2（25mmHg），及不同持续时间（1、2、3小时）干预后，应用流式细胞技术检测其MMP2和MMP9表达水平的变化。结果：高压CO2作用后，胃癌MKN45细胞株MMP2和MMP9蛋白表达有所变化，与常规细胞培养比较，MMP2和MMP9表达差异有统计学意义（P<0.01）。结论：高压CO2环境对癌细胞的侵袭能力影响较大，使胃癌细胞的侵润和

2、转移能力有所增强。【关键词】高压CO2；癌细胞近几年来，应用腹腔镜根治性治疗进展期胃癌取得了较好效果[1]，但关于CO2气腹是否能够提高癌细胞的侵袭力，增加腹腔转移机会还存在争议。因此，我们选择高侵袭力胃癌MKN45细胞株，构建高压CO2环境，体外观察高压CO2对金属蛋白酶MMP2和MMP9表达及对胃癌细胞腹腔侵袭转移能力的影响，为临床广泛开展腹腔镜胃癌根治术提供理论依据。1材料与方法71.1细胞培养及持续高压CO2对细胞的处理选用高侵袭力人胃癌MKN45细胞株（购自上海仁济医院上海市消化病研究所），细胞在

3、含10%小牛血清的PRMI1640培养液中，置入37℃、5%CO2培养箱中常规培养，48小时换液一次。苔盼蓝试剂测定胃癌癌细胞活性≥95%,取对数生长期细胞进行实验。使用容积10L、带2个通气孔的密封箱，CO2气腹机连接进气孔，99.5%医用CO2充入其中，出气孔可排尽空气，密封箱连接压力表可显示箱内压力。将培养瓶中培养的细胞株放入其内，同时置于37℃水箱中，保持细胞生长环境的恒定温度。调节密封箱内压力为25mmHg，维持时间分别为1、2、3小时；对照组细胞常规CO2细胞孵育箱内培养。经压力和时间干预后的细

4、胞，继续在CO2细胞孵育箱内常规培养后待检。1.2待检细胞的准备培养瓶内贴壁细胞用10mLPBS洗涤1次，胰酶消化5分钟后，以PBS人工吹打，细胞悬液计数调整至5×107/mL。将细胞重悬于流式细胞缓冲液中，4℃密封30分钟，离心后加入1∶100稀释的MMP2和MMP9鼠抗人单克隆抗体200μL,对照组则加入1∶100稀释的鼠抗IgG轻轻吹打混匀，37℃孵育30分钟离心后流式细胞缓冲液洗2次，加入1∶50稀释FITC标记的山羊抗鼠二抗100μL，室温避光孵育30分钟，离心后弃上清液，流式细胞缓冲液洗2次，用

5、200目尼龙网过滤后，将细胞重悬于0.5mL流式细胞缓冲液中，4℃避光待查。71.3流式细胞蛋白检测分析使用流式细胞仪（BecKmanCoulterEpicsXL,美国）测定细胞MMP2和MMP9的表达，流式细胞仪488nm的MMP2和MMP9表达量通过平均荧光强度来计量，每样本测定10000个细胞，用无标记和阴性对照样品调节前散射和侧散射，对不同细胞设置GATE，以荧光标记抗体呈阳性的细胞百分率作为胃癌MKN45细胞的MMP2和MMP9蛋白表达的计量单位。检测胃癌MKN45细胞的MMP2和MMP9在持续高

6、压CO2干预后的表达。1.4统计学分析上述实验方法以同样操作重复3次，3次数据以均数与标准差形式表示。采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析，单因素方差分析-均数间差别多重比较LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果使用流式细胞仪测定CO2气腹对人胃癌MKN45细胞MMP2表达的影响，气腹压力达到25mmHg，与对照组常规培养比较，MMP2、MMP9表达率明显增加（P<0.01），而作用时间不同，MMP2、MMP9表达差异并无统计学意义（P＞0.05），见表1。由此可见高压CO2对

7、胃癌细胞MMP2和MMP9表达有很大影响。在高压CO2状态下，二者表达率均明显增高。表1高压CO2（25㎜Hg）对人胃癌细胞MMP2和MMP9表达的影响3讨论7近年来有关CO2气腹对腹腔恶性肿瘤的影响意见不一，其主要问题是手术根治的彻底性、腔镜入径口部转移、CO2气腹对肿瘤术后腹腔转移的影响等。随着腹腔镜操作技术不断提高和手术器械日趋完善，手术根治的彻底性和腔镜入径口部转移问题得到一定程度的解决，而CO2气腹对胃癌细胞侵袭转移能力的影响倍受重视。Abu-Rustum等[2]研究发现，CO2气腹能提高卵巢癌细

8、胞侵袭力，增加腹腔转移机会，降低术后生存期。Lee等进行的动物实验发现结肠癌细胞在CO2气腹下侵袭繁殖能力增强，凋亡减少。Paraskeva等[3]报道CO2气腹环境下会引起结肠癌细胞蛋白表达增强。但Tomita等[4]进行的动物体内实验发现，CO2气腹腔镜手术对结肠癌的生长和繁殖无明显影响，与开腹手术相比，对肿瘤细胞粘附侵袭能力也无明显影响。国7内秦千子等[5]报道了10例腹腔镜辅助胃癌根治术，与同期开腹手术组