2006茶多酚联合5-aza-cdr对高转移性肝癌小鼠的影响

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1、茶多酚联合5-aza-CdR对高转移性肝癌小鼠的影响高寒【摘要】目的探讨联合应用TP与5-aza-CdR对高转移性肝癌小鼠肿瘤细胞生物学特性及小鼠生存率的影响。方法将移植成功肿瘤的小鼠根据用药方法不同随机分成4组，即A、B、C、D组。每组12只，同时选择阴性对照12只，实验后取肿瘤细胞体外进行黏附、侵袭和迁移率及检测CDH1蛋白表达实验，体内实验则取肺、淋巴结检查远处转移情况；取肝组织检查局部侵袭情况，并测量肿瘤体积大小。结果E-cad蛋白表达下降是与CDH1启动子区存在甲基化状态有密切关系，体外研究发现B组与C组在黏附、侵袭、迁移率、死亡

2、、肿瘤体积等各项指标均无统计学差异(P>0.05),与B组比较，D组细胞体外黏附、侵袭、迁移率未见差异，但肿瘤体积却明显下降。体内实验发现B、C两组发生死亡、局部侵袭和肺、淋巴结转移上差异无显著性（P>0.05）；与B组比较，D组死亡发生率明显下降，但局部侵袭和肺、淋巴结转移率上差异无显著性（P>0.05）。与对照组比较,A、B、C、D组在死亡、局部侵袭和肺、淋巴结转移发生率均有统计学差异（P<0.05）。结论高转移性肝癌小鼠CDH1启动子区甲基化直接导致E-cad蛋白表达下降，从而导致侵袭性、转移性、死亡率的提高，应用5-aza-CdR可

3、以逆转这种状态，联合应用TP可以降低5-aza-CdR用量却不改变治疗效果，TP没有降低肿瘤细胞侵袭、转移的功能。【关键词】茶多酚；5-aza-CdR；高转移性肝癌小鼠；侵袭性；转移性【中图分类号】R285.2[文献标识码]A[文章编号]1005-92029(2006)11-1514-0近年来，茶多酚（TP）的抗肿瘤机制研究非常活跃[1]。TP可通过多种途径影响肿瘤形成，包括抑制肿瘤细胞生长、抗突变、诱导肿瘤细胞调亡与分化、抑制新生血管生成等，从对TP和5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-CdR）药理作用上分析，联合应用两药可以从肿瘤细胞

4、周期阻滞上起协同作用，同时也可以在不同的抗肿瘤机制上起互补作用[2]。本文通过联合应用中药提取物TP观察在降低5-zaz-CdR用量后是否可以达到原有用量的相同效果。1材料与方法1.1实验试剂和仪器小鼠高转移性肝癌细胞系Hca/16A3-F(F)由吉林大学基础医学院病理学教研室提供，BALB/c小鼠由吉林大学实验动物中心提供。5-aza-CdR（美国Sigma公司生产）,TP：纯度>95%的黄色粉剂，由浙江省茶叶研究所研制并提供。1.2动物分组及标本采集将F、P细胞用15%胎牛血清RP-MI1640培养液配成107/ml，在SPT条件下的超

5、净层流架中以0.2ml/只浓度接种至6周龄BALB/c小鼠右腋中线胸腹联合部皮下。将移植成功肿瘤的小鼠随机分成A、B、C、D四组。每组12只。A组：单纯给予TP（40mg.kg-1.d-1）代替自来水自由饮用；B组：单纯腹腔每天注入5-aza-CdR1.0ug/g（鼠重），连续3d；C组：联合TP自由饮用和腹腔每天注入5-zaz-CdR0.5ug/(鼠重)，连续3d；D组：联合TP自由饮用和腹腔每天注入5-aza-CdR1.0ug/g(鼠重)，连续3d；阴性对照组12只，腹腔内每天注入生理盐水20ul/g鼠重，连续3d，同时饮用自来水。给药

6、后各组断颈处死6只，取肿瘤细胞体外培养24h后进行黏附、侵袭和迁移及检测CDH1蛋白表达实验。其余在给药5d后断颈处死，取肺、淋巴结检查远处转移情况；取肝组织检查局部侵袭情况，并测量肿瘤体积大小。实验过程中死亡的小鼠退出实验。1.3实验方法1.3.1细胞黏附实验将2.0ug纤黏连蛋白和层黏连蛋白分别铺于96孔培养板中，温室干燥、蛋白封闭、洗涤后每孔加入5X104细胞，37℃培养1.5h加入MTP，继续培养4h后上BIO-RAD检测550酶标仪上测定A540nm值，细胞黏附率以黏附细胞与总细胞A540nm的比值来表示。1.3.2细胞侵袭试验将

7、Polycarbonate滤膜贴于transwell细胞培养小室上，于滤膜上下分别涂纤维黏连蛋白和matrigel。取2.5X109/L浓度的细胞100ul于transwell小室，37℃温育24h后取出，甲醇固定后用棉签擦去滤膜表面细胞，染色、封片。400倍光镜下随机选择5个视野，计数每个视野细胞数目并计算细胞侵袭的百分率，重复做4次。1.3.3细胞迁移实验取50ul4X109/L的细胞加入含187.5ul胶原溶液（1.67g·ml-1）和25ulRPMI1640混合液中。将此悬液加入自制的玻璃小室，置于37℃细胞培养温育30min。用熔

8、化至55℃左右的石蜡凡士林混合液（1：1）密闭玻璃小室。每次实验随机选择30个细胞，应用计算机辅助细胞跟踪系统分析细胞迁移百分率，重复做10次。1.3.4CDH1启动子甲基化分析