嗜碱芽孢杆菌BacillusspN165表达系统的构建

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1、圆幽中国科学院大学UniversitvofChineseAcademyofSciencesV，硕士学位论文密级：2013年5月By。腑nxiaiiuADissertationSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofMasterofScieneeInstituteofMicrobiologyChineseAcademyofScienceMay,2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行

2、研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文不包含任何其他个人或集体己经发表或未发表的成果、数据或撰写过的科研成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书已使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。申请学位的论文与资料若有不实之处，本人愿承担一切责任。学位论文作者签名：享，1划夹洲并5用口日学位论文使用授权声明本人完全了解中国科学院大学及微生物研究所关于提交、保存和使用学位论文的规定。同意研究所保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸制版和电子版，允许论文被查阅和借阅；论文保存单位及借阅人有义务保护论文作者及单位的知识产

3、权。本论文的成果归中国科学院微生物研究所所有；本人离所后发表、使用本学位论文或与本论文直接相关的学术成果时，第一署名单位仍然为中国科学院微生物研究所。(保密论文在解密后遵守此规定)作者签名：如1文依导师签名：月扣日月1／、日>u摘要本研究的目的是构建嗜碱芽孢杆菌Bacillussp．N16．5的表达系统。在构建表达系统的过程中我们首先尝试利用表达载体pHCMC04直接在Bacillussp．N16．5对外源基因幼进行表达，结果用荧光显微镜检测，观察不到荧光，推测pHCMC04所带的启动子无法在N16．5中使用或者由于启动子不强，核糖体结合位点效率太低导致荧光蛋白表达量太低，为此我们

4、对N16．5不同碳源条件，pH下的转录组数据进行排序，找到5个在各种条件下转录水平都较高的基因，通过基因组序列对其ORF上游序列进行分析，推定其可能的启动子，利用启动子预测软件softberry．BPROM对这5个可能的启动子进行预测，进一步证实其符合启动子的特征；另外我们还对其可能的核糖体结合位点区进行了预测和比较，发现它们都带有AGGAGG的序列：以质粒pHCMC04为基础，删除了木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因，插入带有多克隆位点和芽孢杆菌典型SD序列(AGGAGG)的报告基因翰构建了启动子探测载体pABNl65pvT,对这5个可能的启动子及枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43

5、进行了鉴定，找到了2个能在N16．5中使用的启动子PEF和P43．以质粒pHCMC04为基础，利用筛到的启动子，SD序列(AGGAGG)和设计好的多克隆位点，构建表达载体。将报告基因幼连入表达载体构建重组载体，转化Bacillussp．N16．5构建表达系统，利用荧光显微镜检测表达系统的构建情况，并利用多功能荧光读板仪对表达强度进行了定量检测，证明Bacillussp．N16．5表达系统构建成功。关键词：Bacillussp．N16．5，表达载体，荧光检测AbstractWeworkedtoconstructanexpressionsysteminBacillussp．N16—5。

6、Firstly，wetriedtouseexpressionvectorpHCMC04toexpressforeignproteing宙，butnotluorescencewasdetected．WespeculatedthatthepromoterorSDsequencemayinfluencestheexpressionof彭移TogetpromoterssuitableforBacillussp．N16-5，wecombinedtranscriptomedatadeterminedforgrowthonvariouscarbonsource(includingglucose，

7、fructose，mannose．galactose，arabinose，xylosejgalactomannan，xylan，pectin．andsodiumcarboxymeth5，Icellulose)andpromoterpredictionsoftware“softberry-BPROM”．findingfiveprobableconstitutivestrongpromoters．ThenweanalysedtheputativeSDsequenceups