动态高压微射流技术对酶的活性与构象变化的影响

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1、南昌大学博士学位论文动态高压微射流技术对酶的活性与构象变化的影响姓名：刘伟申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：谢明勇20091117摘要白酶残留活性为96％；DHPM对胰蛋白酶最适pH值没影响，而经DHPM80、100和120MPa处理后，胰蛋白酶在最适pH(pH--7．6)的活性有所提高，相对活性分别为97％，102％及103％。对胰蛋白酶构象变化分析表明，动态高压微射流处理后胰蛋白酶荧光强度增强、游离巯基含量增加，总巯基含量减少、紫外吸收强度减弱、伍．helix强度减弱。这说明DHPM处理导致

2、胰蛋白酶的分子构象部分去折叠态。这一成果进一步印证我们关于天然热力学最稳态不一定是其活性最高态的理论假设。胰蛋白酶经DHPM处理后构象部分去折叠态导致其反应稳定性增强。根据热动力学假设，去折叠态的胰蛋白酶并不是处在能量最低状态，而是处于一种热力学不稳定的过渡态，随时可能进行refolding或聚集而丧失其反应稳定性。我们提出新的设想：在酶(或蛋白质)的过渡性构象中，通过Patchthesurface(补丁法)、Doweltheexposedaminoacid(桩法)、Wedgeing印betweenam

3、inoacids(楔法)三种方式来固定其不稳态的去折叠态构象从而维持其更高活性的策略和理论设想。本实验采用mPEG．SC修饰即补丁法策略，结果表明：与天然胰蛋白酶(NT)相比，经DHPM处理后unfolding胰蛋白酶(DT)经mPEG．SC修饰后(NTP、DTp)，其储存稳定性和热稳定性显著增强。在40C贮存8后，NT和NTP变化不大，分别保持61％和59．9％；80和100MPa不同压力处理下经mPEG．SC修饰的DsoTp和DlooTp相对活性分别保持在78％和74％，而未修饰的D80T和Dloo

4、T相对活性分别陡降到56．5％和50％；热稳定性方面，55oC处理10min后，DsoTp和D100Tp相对活性均保持在87％左右，而D80T和DlooT仅存70％的相对活性。目前学术界对热稳定性机理没有统一的解释，认为导致酶或蛋白质热稳定性的原因主要有以下几个方面：表面疏水性／亲水性的变化、表面电荷分布的变化、热变性速率和自水解速率的降低、氢键的形成及解链温度的降低。本实验表明mPEG．SC修饰后，去折叠的胰蛋白酶分子内残基之间的相互作用以及残基和介质之间的相互作用发生了变化，导致去折叠胰蛋白酶的分子

5、构象发生变化，可能是其热稳定性增强的原因。比较分析DHPM不同chamber(美国Microfluidics公司M．chamber和中国廊坊通用机械公司的反应腔L．chamber)对木瓜蛋白酶性质和构象变化影响的结果表明，两种chamber都导致木瓜蛋白酶活性降低，巯基含量升高。160MPa下处理三次后，M．chamber处理的木瓜蛋白酶(MP)相对活性降低至II摘要76．02％，巯基含量增加至110．89％，而L．chamber处理的木瓜蛋白酶(LP)相对活性保留在86．28％，巯基含量为105．36

6、％；MP紫外吸收峰发生蓝移，酪氨酸和色氨酸的荧光最大发射峰红移而LP紫外吸收和荧光光谱几乎没有变化。实验表明在相同的处理压力和处理条件下，不同的chamber仍会导致木瓜蛋白酶产生不同的性质和构象变化，从而证实了我们所提出的“伪压"现象。通过PyMOLWin软件构造出天然木瓜蛋白酶三维结构模式。在此基础上并根据实验中测得的去折叠态木瓜蛋白酶的构象变化，预测了M—chambers处理后去折叠态木瓜蛋白酶的三维结构图。与天然木瓜蛋白酶相比，去折叠态木瓜蛋白酶结构更加松散、二硫键断裂、酪氨酸和色氨酸残基暴露、

7、o【．helix含量降低。关键词：动态超高压微射流技术；多酚氧化酶；胰蛋白酶；木瓜蛋白酶：活性；构象变化；去折叠态ⅡIABSTRACTDynamicHigh—pressuremicrofluidizationOHPM)is趾emergingnonthermaltechnology,whichusesthecombinedforcesofhigh—velocityimpact，high—frequencyvibration，instantaneouspressuredrop，intenseshear,ca

8、vitation,andultra—hi曲pressuresupto200MPa．Thisnewtechnologyisbasedonaveryhighpressurecapacityaswellasonanewdifferentreactionchambergeometrydesign,whichcanattainpressures10—15timeshigherthanclassicalvalvehomogenizers．Itopera