阴沟肠杆菌B8拮抗相关基因簇的克隆及功能验证

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1、浙江大学动物科学学院硕士学位论文阴沟肠杆菌B8拮抗相关基因簇的克隆及功能验证姓名：朱军莉申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：余旭平20040501浙江大学硕：L学位论文摘要阴沟肠杆菌B8是从水稻叶面分离获得的一株广谱拮抗菌．最初分离筛选时以白叶枯病菌作为指示菌，发现它对白时枯病菌具有很强的拮抗活性，网室及用闽定殖和抗白叶枯病试验也取得了较满意的结果。进一步发现它对水稻和蔬菜等的多种病原有良好的拮抗效果，还对人和动物的葡萄球菌等细菌也具有良好的抑制作用，因此它是一株具有良好生物防治潜力拮抗细菌。本研究从基因水平对B8菌株拮抗分子机理进行了研究，为该菌株更好地应

2、用于生物防治提供理论基础。通过转座子标签法已获得拮抗活性消失的突变菌B8F和B8B。并克隆到质粒pTLF和pTLB。经亚克隆测序获得pTLF质粒的735bpF片段序列，应用GPS．1系统测序获得pTLB质粒的2608bpB片段序列。在获得这两个片段序列基础上，设计合成多种接头，构建不同接头的多个B8基因组文库．应用相应的接头引物和根据己知序列设计的特异引物进行PCR，经4次染色体步行获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的2586bp序列和右侧的664bp序列，与F片段序列拼接，获得3985bp的Fcontig序列；经2次步行获得了B片段右侧的2003bp序列，与B片段

3、序列拼接，获得461lbp的Bcontig序列。生物信息学分析显示，Fcontig中包含4个ORF，与Pantoeaagglomerans的andrimid生物合成基因簇(AYl92157)的admL、admM、admN和admO四个基因有较高的同源性：被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF)对应于admM(polyketide合酶基因)，插入位点位于该基因的2369bp处，即终止密码前214个碱基。而Bcontig序列包含7个ORF，3个位于Tn5插入位点的左侧，依次为约200bp的3．磷酸甘油醛脱氢酶基因片段、390bp的调控因子ORF和450bp未知功能的O

4、RF，在前两个ORF间的还有一段600bp与耶尔森氏菌高致病力毒力岛问有一定同源性的序列：4个0I心位于Tn5插入位点的右侧，其中3个分别与andrimid生物合成基因簇的admA、admB和admC三个基因对应并有较高的同源性，另～个408bp的ORF(命名为anrP)位于'admA’基因前286bp处．Tn5插入于'admA’基因前894bp的“非编码区”，即anrP基因上游200bp处。同时对Tn5插断的彻rF基因和ArtrB片段进行PCR验证及片段两端测序。由此证明我们已经克隆到f5f】沟肠杆菌B8拮抗相关基因片段。为了证明阴沟肠杆菌B8的基因组存在类似an

5、drimid生物合成基因簇的拈抗相关基因簇，本研究应用了长距离PCR(LAPCR)扩增大片段DNA。选择B3750—90浙辽大学硬士学但论文和F2000引物，并应用EXTaq酶扩增出‘admA’基因和anrF基因之间预期的12．5kb片段。PCR产物经HindIII酶切后。获得BAI、BA2和BA3三条带，将两端均带有HindIII酶切末端的BA2片段克隆到经HindIII酶切和CIAP处理的pUCl8质粒，并对BA2整个片段进行了测序。在已知BA2片段序列的基础上．设计扩增BAl’和BA3’片段，并对BAI’片段进行了克隆和全序列测定。对BAl’、BA2序列编辑和

6、拼接后，得到4997bp的BAcontig，生物信息学分析显示该序列与andfimid生物合成基因簇中的admC、admD、admE、admF、admG和admH有较高的同源性。另一方面，根据admT和admU基因的序列设计引物，扩增出436bp对等的‘口咖，丁’基因片段，而没有得到'admU’基因片段。对该片段测序后，合成用于步行的引物．获得了包含饥砌r鼍毒因及下游的517bp序列。对已获得868bp序列分析显示对等基因admT问的核苷酸和氨基酸的同源性分别为83．6％和89．7％，但是在3’端有一个氨基酸的缺失：而下游非编码区序列与admT和admU基因间的非编

7、码序列间同源性较低，并存在缺失和插入突变。与此同时，以"admO’基因上的FSl和。admT’基因上的admT588为配对引物，应用EXTaq酶PCR扩增出8288bp目的片段。由此可见，我们己获到了B8拮抗相关基因簇的整个序列，并对部分基因迸行了测序。从得到的序列中发现，B8拮抗相关的基因在基因大小、结构、阅读框架排列等多方面与andrimid生物合成基因簇序列完全对应；从同源性分析也显示在基因的编码区内核苷酸和氨基酸的同源性均很高，在75％．92％之间，而非编码区包括两种基因簇的上游非编码区、臼咖国’和'admE’之间的非编码区及'admT’基因下游的非编码