辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒分子鉴定与检测技术

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1、河北农业大学硕士学位论文辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒分子鉴定与检测技术姓名：李志勇申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：董金皋;李兴红20050614摘要甜(辣)椒广泛栽培于世界各地，是重要的蔬菜之一。通常由病毒病造成甜椒减产达25％～50％，严重时造成毁种绝收。近年来，北京、保定和宁夏部分地区甜椒病毒病发生非常严重，已严重影响当地甜椒的生产，为此对上述3地部分地区甜椒毒源进行鉴定，主要结果如下：一、通过血清学检测6种病毒(烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、苜蓿花叶病毒和非洲木薯花叶病毒)，检测结果表明宁夏银川、惠农和平罗甜椒毒源主要为黄

2、瓜花叶病毒，保定郊区甜椒毒源主要为辣椒轻斑驳病毒，北京郊区甜椒毒源主要为辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒。=、对辣椒轻斑驳病毒寄主范围测定，发现辣椒轻斑驳病毒局部侵染蔓陀罗、苋色黎、昆诺阿黎、普通烟、心叶烟、枯斑三生烟，系统侵染辣椒、矮牵牛、千日红，不侵染黄瓜、番茄、蕃杏、甜瓜、苦瓜、生菜、白菜、甘蓝、蚕豆。对16个甜椒品种抗病鉴定，发现供试品种均感病。三、以PEG6000沉淀病毒和差速离心提纯辣椒轻斑驳病毒，提纯病毒负染后电镜观察到大量杆状病毒粒体。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测得，辣椒轻斑驳病毒蛋白亚基分子量为20KDa。精提纯病毒五次免疫兔子，DAS—E

3、LISA测得所制各辣椒轻斑驳病毒多克隆抗体效价为32768。四、用Trizol提取病叶总RNA，反转录为cDNA。通过3对特异性引物，分别扩增出病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因和与病毒复制相关蛋白基因。PCR产物经纯化测序分析表明北京、保定两地辣椒轻斑驳病毒分离物核甘酸序列同源性99．7％，它们与日本AB000709最为接近。五、血清学和黄瓜花叶病毒外壳蛋白核甘酸序列分析表明，宁夏和北京分离物都为亚组I成员，北京分离物与IB亚组的美国分离物(AFl27977)同源性最高，宁夏分离物与IB亚组的美国分离物(AJ271416)同源性最高。六、血清学结果表明

4、，甜椒种子带毒率很高，但未发现辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒传毒。本试验从生物学、血清学、病毒粒子形态、分子生物学4个方面，鉴定了在保定和北京发生日益严重的甜椒病毒为辣椒轻斑驳病毒。制各了高效价的抗血清，为今后用血清学检测辣椒轻斑驳病毒奠定基础。辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列的测定，为今后抗病毒转基因工程奠定基础。关键词：甜椒；辣椒轻斑驳病毒；黄瓜花叶病毒；双抗体夹心酶联检测：反转录一聚合酶链式反应MolecularIdentificationandDetectionMethodsofPepperMildMottleViruses＆Cucum

5、berMosaicVirusesSpecialty：PlantPathologyMastercandidate：LIZhi-yongSupervisor：DONGJin-gaoAbstractSweet(hot)pepperwerewildlycultivatedallovertheworldanditwasoneofmostimportantvegetables．Generalspeaking．thelossescausedbypeppervirusaccountfor25～50percentoftotalyield，buttotalyieldcanb

6、elostwhenthediseasewassevere．ThepeppervirusthreatenedthecultivationofpepperinBeijing，BaodingandNingxia，SOsomesamplewerecollectedtoidentifythevirusesbyserologicalmethods．Thefollowingproblemswerestudiedanddiscussed．Sixplantviruses(TMV，CMV，PMMV，AMV，ACMV，PVY)weredetectedbyELISAkit．Th

7、edetectionresultsshowNingxiaandBandingpeppervirusdiseaseweremainlycausedbyCMV，PMMVrespectivelyandBeijingpeppervirusdiseaseweremainlycausedbyPMMV，CMV．ThehostrangeexperimentshowPMMVsystemicallyinfectedCapsicumannuum、Capsicumfrutescens、Gomphrenaglobosa、Petuniahybrida，butitdoesn’tinf

8、ectCucumissativus、Lycopersicone$culentum