湖北省黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒的检测与分子鉴定

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1、摘要新的植物RNA/DNA病毒病的出现和流行是目前世界农业领域面临的最大威胁之一。近年来，世界范围内新发现了20多种新的危险性病毒，黄瓜绿斑驳病毒和番茄黄化曲叶病毒就是植物病毒中的典型代表。本研究主要开展了CGMMV（Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV）以及TYLCV（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）的鉴定以及分子序列分析等研究工作，为CGMMV和TYLCV的快速诊断提供一定的理论和技术依据。主要实验结果如下：以湖北省武汉市的多种葫芦科作物以及禾本科叶片为材料，设计并合成扩增外壳蛋白序列引物，

2、通过RT-PCR方法检测，在该地区西瓜，南瓜以及玉米病叶上检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒。在对RT-PCR反应体系及扩增程序进行了优化的基础上，建立了OneStepRT-PCR方法，将分离物扩增得到的CP(CoatProtein)基因进行T-A克隆，经核苷酸序列分析结果表明，该分离物CP基因全长为486bp，编码161个氨基酸，理论分子量为17.3kDa蛋白，与国内外已经报道CGMMV的CP基因相比，其核苷酸序列的平均同源性为98.2%，具有很近的亲缘关系。番茄黄化曲叶病毒属烟粉虱传双生病毒，根据其外壳蛋白(CoatProtein,CP)基因保守序列设计并合成一对简并

3、引物，对采集到的番茄上疑似病例进行PCR检测，经扩增获得一条约500bp的DNA片段，并将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序鉴定。经测序和序列比对，结果表明湖北省感病番茄上发生的病毒是番茄黄化曲叶病毒，并且同其他地区病毒核苷酸序列的同源性达95%-99%。全序列测定表明，DNA-A全长为2781bp，是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒。依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法，结合碱裂解法提取质粒DNA的原理，经过试验摸索，应用了快检缓冲液直接裂解菌液，电泳后筛选重组质粒的方法，避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤，其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致，可以

4、快速筛选出重组克隆。关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒；番茄黄化曲叶病毒；外壳蛋白基因；RT-PCR；序列分析AbstractThenewplantRNA/DNAvirushaveemergedandepidemicedareoneofthebiggestthreatfortheworldagriculturalfields.Inrecentyears，theworldwidehavefoundmorethantwentynewriskvirus，CucumberGreenMottleMosaicVirusandTomatoyellowleafcurlviruswere

5、thetypicalrepresentative.Inthisstudy，methodsofidentificationandmoleculardetectionofCGMMVandTYLCVweredeveloped，theresultscanprovidereferenceforquarantinedepartment.Majorresultsaredescribedasfollows：Apairofprimersweredesignedandsynthesizedbasedontheconservedsequenceofcoatproteingenesof

6、CGMMV.ThesamplesinfectedCGMMV-likeweredetectedbyRT-PCR.Theresultsshowedthataspecificfragment(about650bp)wasamplifiedfromtheWatermelon，PumpkinandMaizeleaveswhichwascollectedfrominWuhancity，Hubeiprovince.OnestepRT-PCRmethodwasestablishedbyoptimizingtheRT-PCRreactionsystemandamplificati

7、onprocedures.RT-PCRproductswereclonedintothevectorpMD18-T，SequencesanalysisshowedCPgeneofthreeisolateshave486nucleotide，whichencoding161aminoacids.AccordingtocompareswithnucleotidesequencesinGenBank，sequencesanalysisindicatedthatthefragmentoftomatosamplessharethehighestsequencesinden

8、titywithCGMM