肠上皮干细胞标志分子在小肠各段的表达特征及与小肠上皮增殖的关系

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1、◇中《碴篦蚕曩肠上皮1：细胞标志分子在小肠各段的表达特征及与小肠卜皮增殖的关系肠上皮干细胞标志分子在小肠各段的表达特征及与小肠上皮增殖的关系中山大学附属第二医院消化内科专业：内科学硕士研究生：龚瑜导师：陈其奎教授摘要干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的未分化细胞，不仅存在于胚胎早期，而且在成体多个组织或器官中也有定植，是维持该组织／器官正常代谢及病理状态下修复损伤的主要细胞来源。小肠上皮组织主要由吸收细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞及潘氏细胞四种分化成熟的细胞组成。小肠上皮不断进行着自我更新，使上皮细胞的衰老死亡和增殖分化处于平衡状态，这一功能是由肠上

2、皮干细胞(intestinalepithelialstemcell，IESC)来维持的。目前认为IESC位于小肠隐窝的基底部，距底部约4～6个细胞的位置。通过测定IESC标志基因明确其在整个小肠的分布情况及与小肠上皮增殖的关系，有助于进一步探讨IESC的生理功能，对研究干细胞在组织损伤修复和肠道肿瘤发生过程中的作用也有重要意义。Musashi一1(Msil)是一种进化保守的RNA结合蛋白，在维持干细胞自我更新、分化和肿瘤发生方面起着重要作用。在哺乳动物小肠中，Msi1在距隐窝基底部4～6个细胞处的细胞中表达，与公认的IESC位置相符，提示Msil可以作为I

3、ESC的标志分子。Musashi_2(Msi2)也是Musashi家族中的成员，它和Msil在神经前体细胞共同表达，在维持细胞干性和细胞增殖中发挥重要作用。但是，目前为止尚未见有关Msi2和Msil在整个小肠中的分布特征的报道。Hairyandenhancerofsplit1(Hesl)是一种基本螺旋一环一螺旋结构的◇”卞≮霹鬓!圈肠上皮T．细胞标志分子在小肠各段的表达特征及与小肠上皮增殖的关系转录因子，是Notch信号通路的下游分子之一。研究表明，Hesl和Ms“在成体及胚胎阶段的小鼠小肠中均共表达于肠隐窝底部的IESC。但是直到现在，对Hesl和Msi

4、l阳性细胞的定位和表达水平的研究仅限于小肠中的某一段，Msil、Msi2和Hesl在整个小肠中的表达特征、相互之间的关联，以及上皮细胞增殖与各标志基因表达的关系均未见报道。本次研究通过在mRNA及蛋白质水平上测定Musashi家族基因(Msil和Msi2)和Hesl在小鼠整个小肠中各段的表达，明确各基因的表达特征，并与采用BrdU和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫染色方法所获得的小肠上皮增殖指数进行对比，探讨在整个小肠的范围内IESC标志分子表达与肠上皮增殖之间的关系。研究目的1．通过测定IESC的标志分子Msil、Msi2及Hesl在各段小肠中的表达，探讨

5、各基因在整个小肠中的表达特征；2．探讨各标志分子的表达与小肠上皮结构特征和增殖的关系。研究内容及实验方法1．实验动物及组织来源所有实验动物来源于广州中山大学实验动物中心。取8周BALB／c小鼠6只(3雄3雌)。所有小鼠脱颈处死前2小时均给予BrdU腹腔注射，注射剂量为1m1／1009。完整取出整段小肠，去除头端的5cm，剩余小肠等分为4段，分别为命名为空肠一l、空肠一2、回肠一l及回肠一2。每段小肠用0．1MPBS(pH7．4)冲洗干净用于下一步研究。2．组织学分析各段小肠组织标本取中间一段约1cm，经4％多聚甲醛固定，常规脱水后石蜡包埋，连续切片，分别用

6、于HE组织形态学和免疫组化分析。在组织学分析小肠各段形态特点中，计算绒毛一隐窝高度和隐窝密度。绒毛一隐窝高度计算方法为绒毛顶端至隐窝底部的垂直距离；隐窝密度的计算方法为计算300“m单位长度小肠中的隐窝数量。3．实时定量PCRll◇：◆《曛霞冒肠一卜皮千细胞标志分子在小肠各段的表达特征及与小肠上皮增殖的关系总RNA用TRIz01一步提取法，通过UV一2450分光光度计计算样品260nm处紫外光吸收值来计算分离出的总RNA浓度。使用ReverTraAce—a试剂盒将1“g的总RNA逆转录为cDNA。在Rotor—Gene6000型机器上使用RealtimeP

7、CRMasterMix试剂盒进行实时定量PCR。每次实验重复两次，取平均值以备下步分析。引物如下：d、鼠Msil，5’一TAGTTCGAGGGACAGGCTCT一3’(—匕游)和5’一GTTGAGGGACAGGCAGTAGC一3’(]：游)；，J、鼠Msi2，5’一CCGGAGTGGGGAATTACATA一3’(j二游)和5’一CATAGTGAGACGGCAATGGA一3’(下游)；／J、鼠Hesl，5’一GGAGAGGCTGCCAAGGTTTT一3’(上游)and5’一GCAAATTGGCCGTCAGGA一3’(]；游)；／J、鼠18S核醣体RNA(18

8、SrRNA)，5’一GCTAGGAATGGAATAGG一3’(上游