天然植物小分子活性物质对人成骨肉瘤的作用研究

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1、厦门大学博士后学位论文天然植物小分子活性物质对人成骨肉瘤MG-63细胞作用研究姓名：石松林申请学位级别：博士后专业：化学指导教师：林昌健;李祺福20080701内容摘要本研究以植物天然活性成分单体人参皂甙R91、肉桂酸、丹参酮11A的组合(RCT)及姜黄素处理人成骨肉瘤MG．63细胞，鉴定它们埘人成骨肉瘤细胞的抗肿瘤生物学效果。在此基础上，综合应用亚细胞蛋白质组学及免疫细胞化学分析等技术，对MG．63细胞诱导分化及凋亡过程中的核基质构型及组分进行了系统研究。分析和确证了特异核基质蛋白Prohibitin(PHB)和Nucleophosmi

2、n(NPM)等蛋白的变化，并进一步研究特异核基质蛋白PHB、NPM在植物天然活性成分抗肿瘤生物效应中的调控作用。以期能够在较为整体水平上阐明植物天然活性成分诱导肿瘤细胞分化与凋亡的作用机制并进一步认识细胞癌变与逆转调控机理。实验结果显示，RCT组合能有效抑制人成骨肉瘤MG．63细胞增殖活动，改变MG．63细胞形态与结构特征，并增强I型胶原、骨钙蛋白、骨粘素的表达和钙化糖原颗粒及典型骨结节的形成；而姜黄素则诱导人成骨肉瘤细胞出现凋亡细胞特有的形态学特征和凋亡指标：细胞的增殖发生了G0／G1期阻滞，出现明显的亚GO／G1期凋亡峰，处理后的MG

3、．63细胞出现了核质比例减小、细胞核固缩、核内染色质凝聚、线粒体肿胀、内质网网腔扩大、出现凋亡小体等显著的凋亡特征；并且出现细胞凋亡特征性DNA降解梯状条带。选择性抽提整装光镜和电镜观察显示，经RCT组合处理的MG．63细胞的核基质纤维和中间纤维发生可趋向正常细胞形态的改变；而姜黄素诱导的人成骨肉瘤细胞核基质和中间纤维比对照组具有明显的凋亡细胞特征。RCT分化诱导处理前后细胞的双向凝胶电泳及MALDI--TOF质谱分析共鉴定出17个在MG．63细胞分化前后存在差异表达的核基质蛋白；姜黄素诱导凋亡前后细胞核基质蛋白的双向凝胶电泳及质谱分析鉴

4、定了的21个差异蛋白。其中表达下调的PHB和NPM蛋白为人成骨肉瘤MG．63细胞分化或凋亡过程中都发生了变化的功能性特异核基质蛋白。蛋白印迹杂交与免疫荧光显微镜观察确证了PHB和NPM等在MG--63细胞分化及凋亡过程中的表达变化。免疫荧光激光共聚焦显微镜观察结果显示PHB与相关调控蛋白在细胞内有共定位关系，共定位荧光强度与细胞定位在诱导分化与凋亡前后发生了变化。免疫共沉淀实验显示PHB与Rb及Bax具有直接相互作用。研究表明，RCT对人成骨肉瘤细胞的终末分化具有显著诱导作用，而姜黄素则能显著诱导人成骨肉瘤MG．63细胞的凋亡。在分化和凋

5、亡诱导过程中出现了多种核基质蛋白表达水平的显著变化。而与细胞分化或凋亡相关的癌基因c-myc、c．fos和抑癌基因p53、Rb及凋亡相关基因bcl．2、bax和风基因的表达都发生了变化。特异核基质蛋白PHB这些基因产物具有共定位关系和变化。由此证实了植物活性小分子RCT组合及姜黄素能够干预MG．63细胞相关癌基因、抑癌基因的活性，改变一些与细胞DNA复制、RNA转录加工与运输、基因表达和信号转导相关的重要核基质蛋白的表达，进而阻滞细胞周期，促使人成骨肉瘤细胞分化或凋亡。从而为在较为整体的水平上深入研究植物活性小分子物质抗肿瘤作用机理提供了

6、科学依据与探索研究的新方向，并为肿瘤的病理诊断和抗癌药物研究等提供新的靶向性蛋白。关键词：人成骨肉瘤；分化；凋亡；核基质；亚细胞蛋白质组学：4AbStraCtInthisstudythenaturalactiveingredientsincludingthemixtureRCTcontainingginsenosideRg1．cinnamicacid，tanshinoneIIandcurcuminwereusedtotreathumanosteosarcomaMG．63cellandtheiranti-tumorbiologicaleff

7、ectswereestimated．TheconfigurationandcompositionofnuclearmatrixatMG．63celldifferentiationandapoptosisprocessweresystematicallystudiedbythemethodsofsubcellularproteomicsandimmunocytochemistry．Thechangesofaseriesofnuclearmatrixproteinssuchasprohibitin(PHB)andNucleophosminwe

8、reanalyzedandconfmned．AndtheregulatoryrolesofPHBandNPMintheanti．tumorbio．effectsofplantnaturalac