基因工程常用分子生物学技术

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1、基基因工程因工程常用常用分子生分子生物学物学技术技术PDF格式由生物秀物秀【【www.bbioo.com】】制作仅供学习参考版权归原作者原作者第一节第一节凝胶电泳技术凝胶电泳技术一、电泳的原理将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Pol

2、yanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。常用固体支持介质琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyarylamide）都属于固体支持介质，使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，使得被分离的成分得到最大的分辨率。这些固体支持介质可以形成复杂的网孔结构，DNA要穿过这些网孔才能到达正极，因此分子量小，结构致密的DNA分子就更容易穿过这些网孔，泳动的速度也越快。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围0.3%琼脂糖50000~1

3、0000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004%聚丙烯酰胺1000 ~10010%聚丙烯酰胺500 ~2520%聚丙烯酰胺50 ~1二二、琼脂、琼脂糖凝胶电糖凝胶电泳泳琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分子结构大部分是由1,3联接的β吡喃半乳糖，1，4联接的3，6脱水αD吡喃半乳糖交替而成的，其结构为：染色：在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。三三、聚丙

4、、聚丙烯酰胺凝烯酰胺凝胶电泳胶电泳聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯酰胺的单体形成长链，由N，N′甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢神经毒物。N，N’甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50）为170mg/㎏，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触

5、和吸入粉尘。聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N′，N′四甲基乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，从而加速聚合。第二节第二节探针技术探针技术探针（probe）：用来探知被测物存在的小分子DNA或RNA。标记物：探针上结合的易被检测的化合物。分子杂交（molecular hybridization）：探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫分子杂交。核酸探针：DNA、RNA 探针非核酸探针：酶、蛋白质等一一、核酸、核酸探针探针核酸探针的类

6、型和称谓常有以下几种：双链DNA探针DNA探针DNA探针核酸探针单链DNA探针cDNA探针RNA探针单链RNA探针放射性标记探针均匀标记探针探针标记非放射性标记探针非均匀的末端标记探针1.双链双链DNAA 探针⑴切口平移法利用了DNaseI和DNA聚合酶I的5 ’→3’聚合酶活性和5 ’→3’外切酶活性。产生均匀标记的探针。⑵随机引物合成法原理：随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成与模板互补的DNA探针。优点是：(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性

7、,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA 模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×10 9cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。2.单链单链DNAA 探针双链探针的缺点：易形成自身无效杂交。⑴从M13载体衍生序列合成单链DNA探针[α32 P]dNTP 限制性酶切割电泳分离⑵从从RNA合成单链成单链cDNA探针方①用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于法：带Poly(A)的mRNA，并且产生的探针极大多

8、数偏向于mRNA 3'末端序列。②可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列，往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经Sephadex G50 柱层析即可得到单链探针。33 、、寡核苷酸探针若只知道待分离的目的基