分子生物学常用检测技术

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1、分子生物学常用检测技术及临床应用DNA—四种核苷酸（A-T-C-G)组成的多聚骨架所有组成DNA的核苷酸dATP,dTTP,dCTP,dGTP都由三种成分组成：1）一个2’-脱氧核糖（戊糖）2）一个含氮碱基嘌呤：AG嘧啶：T/C3）三个磷酸基团各单个核苷酸由5’和3’-碳形成的磷酸二酯键连接在一起变性、复性、退火和淬火基因分子生物学常用技术PCR（聚合酶链式反应）核酸分子杂交基因芯片技术(biochip)DNA测序（DNAsequencing）DNA重组技术(DNArecombination)一、聚合酶链反应（PolymeraseC

2、hainReaction，PCR）体外基因扩增技术特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术（一）PCR原理原理双链DNA变性退火链延伸（膜板）（双链分成单链）（膜板与引物杂交）（DNA合成）不断重复PCR反应体系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaqDNA聚合酶模板引物和或和（二）PCR反应的设计及影响因素PCR的种类荧光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR……TaqMan探针reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5

3、'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'荧光定量PCR定量PCR的数学原理PCR理论方程N=N0x(1+E)nN：扩增数量N0：起始模板数量E：扩增效率N：循环数Log[DNA]循环数线性增长期Linear平台期Plateauy=N0(1+e)n指数增长期Geometric定量

4、PCR的数学原理Rn(荧光强度)循环数CycleNumber指数增长期平台期CT=-klogN0+bCt（Cyclethreshold）值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值（threshold）时所经历的循环数。PCR的临床应用对病原微生物核酸进行快速检测弥补免疫检测的缺陷缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV）用于药物疗效监测和评估用于肿瘤基因表达方面的研究用于遗传病的诊断项目标本采集HBV无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或体液标本。2.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。CMV1.尿液

5、：中段晨尿20ml于加盖试管。其他体液标本或咽拭子。也可取抗凝血标本,但一般不推荐。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试管。2.其他组织标本：留于无菌试管。3.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。MP呼吸道病毒咽拭子样本采集要求项目标本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜）。前列腺液、精液。女性：阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性无菌带盖的试管。NGUUTPHPVHSV二、核酸分子

6、杂交根据核酸变性和复性的原理，不同来源的变性单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交（molecularhybridization）。1、遗传病的诊断2、病原体的鉴定3、癌基因突变的检测4、组织配型5、亲子鉴定核酸分子杂交的临床应用三、基因芯片技术基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等。用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列原位合成法在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列基因芯片技术的应用1、药物筛选和新药开发2、疾病诊断3、环境保护4、司法5、现代农业四、测序技术CTTGA

7、TCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代测序技术（二）二代测序技术Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。技术特点比较第一

8、代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性