L1-ORF2不同位置串联片段及简单重复序列调节GFP报告基因表达

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1、中文摘要L1．ORF2不同位置串联片段及简单重复序列调节GFP报告基因表达摘要目的：人类基因组约有40．50％的序列属于重复DNA序列，长散在核元件(10nginterspersednuclearelements，LINEs)是其中重要的一种类型。LINEs包括LINE一1(L1)和LINE．2(L2)，前者占据了人类基因组的16．9％。基因组中的Ll多数为不完整序列，且大多数Ll重复序列在人类基因中以反序形式存在。IL．2基因，T细胞受体基因侧翼含有丰富的L1序列。因为Ll在基因组中多数呈不完整片断分布，所以有必要研究L1片段对基因表达的影

2、响。L1．ORF2(L1重复序列第2读码框)按正序方向插入pEGFP．C1(C1)质粒的GFP基因下游，强烈抑制GFP基因表达，反序方向插入则导致GFP转录提前终止，但并不清楚L1．ORF2的这种特性是其整体特征还是由个别片段造成。为了研究L1．ORF2不同片段对上游基因的影响，将来自Xql3．1位置的L1．ORF2(L1PA3家族)不同位置片段(各280bp)及Alu元件(283bp)的8串联体，分别按正、反序方向插入C1质粒，瞬时转染HeLa细胞，Northern杂交和荧光显微镜检测下游序列对GFP基因表达的影响。富含“A’’碱基是L1．

3、ORF2的序列特点，“A”碱基含量为40．89％，为了研究富含“A”碱基的简单重复序列是否有正、反序列影响GFP基因表达不同的特征，将736bp的(AAACAAA)n或(AG)n按正、反方向插入Cl质粒，观察简单重复序列对GFP基因表达的影响。中文摘要方法：1重组质粒构建设计5对带合适酶切位点的引物(Table1)，用RPll-29107克隆作模板，分别扩增5段L1．ORF2片段(各280bp)。PCR扩增片段与C1质粒经酶切和T4DNA连接酶连接，获得5种插入一个片段的重组质粒。XbaI和NheI的粘性末端可以用T4DNA连接酶连接，但是连

4、接后不被XbaI和／或NheI切断，利用该特性反复同向串联构建出含8串联片段的重组质粒。将8串联重组质粒插入片段反向插入，筛选出反序重组质粒。构建缺失3’端序列的ORF2(3212bp)片段反向插入表达载体，命名为p280．1～8as。合成上游带有EcoRI和XbaI酶切位点，下游带有NheI和KpnI酶切位点，中间分别带有AAACAAA或AG简单重复序列的寡核苷酸，引物扩增使其成双链，扩增片段与C1质粒经酶切后连接，串联重复，获得含有正、反序简单重复序列(736bp)的重组质粒，命名为p(AAACAAA)Rep，p(AAACAAA)Repa

5、s，p(AG)Rep，p(AG)Repas。2细胞转染将构建成功的重组质粒和Cl质粒分别以脂质体法转染HeLa细胞，37℃、5％C02环境培养36小时，12孔板细胞用于提取RNA，24孔板细胞用于荧光观察。3Northem杂交用Trizol提取质粒转染的HeLa细胞总RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，毛细法将RNA转移到尼龙膜。Q．32P标记的GFP探针杂交、冲洗后放射自显影。尼龙膜用剥离液处理，冲洗后用检测Neo(neomycinresistancecassette)RNA的探针再次杂交，作为对照。4荧光阳性细胞计数转染质粒的HeLa细胞经4

6、％多聚甲醛固定，×100倍视野白光下计数细胞总数，同样视野中文摘要紫兰光下计数荧光阳性细胞数，计算荧光细胞阳性率。结果：1重组质粒1．1重组质粒构建构建以下18种重组质粒：p280—1水8as，p280—2半8，p280-2串8as，p280—4木8as，p280—5木8，p280—5木8as，p280—7术8，p280—7水8as，p280-8半8，p280—8木8as，p280—9丰8，p280—9水8as，pAlu水8as，p280—1-8as，p(AAACAAA)Rep，p(AAACAAA)Repas，p(AG)Rep，p(AG)Re

7、pas。经酶切(Fig．2，Fig．4)，PCR(Fig．3，Fig．4)，测序(Fig．5，Fig．6，Fig．7)鉴定正确。1．2其它重组质粒p280．1"8、p280．4*8、pAlu*8、pORF2及pORF2as为本研究室其它工作构建。本研究所使用的全部质粒及说明见Table2。2L1．ORF2不同串联片段和Alu串联序列对GFP报告基因表达的影响2．1Northem杂交分别用L1．ORF2串联片段和Alu串联正、反序重组质粒转染HeLa细胞，提取总RNA，Northern杂交，结果(Fig．8)显示所有L1．ORF2串联片段中反序

8、GFP基因的表达均高于正序，Alu与L1．ORF2片段不同，正序的GFP基因表达高于反序；不同串联片段转录终止位置不同，p280-l枣8、p280—5术8、p280