CVB3VP1蛋白与重组腺病毒及重组质粒联合应用的免疫效果

《CVB3VP1蛋白与重组腺病毒及重组质粒联合应用的免疫效果》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中文摘要CVB3VPl蛋白与重组腺病毒及重组质粒联合应用的免疫效果摘要目的：柯萨奇病毒B组3型(CoxsackievirusgroupBtype3,CVB3)感染所致的病毒性心肌炎严重危害人类健康，也是新生儿猝死的重要原因，迄今尚无有效的预防方法。VPl是CVB3的主要衣壳蛋白，可诱导机体产生免疫应答。研究表明，编码VPl的DNA疫苗能诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答，并对小鼠有一定的保护能力，但不能有效阻止致死量病毒感染。目前提高免疫效果的关键因素之一是开发具有较高基因转移率和靶向特异性的转基因载体。在众多载体体系中，复制缺陷型腺病毒载体系统以其广泛的宿主范围、极高的转染

2、效率、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点，在疫苗载体选择中表现出优势，成为极具应用前景的基因转移载体。但由于腺病毒载体自身免疫原性较强，对自身抗原产生免疫应答而不能多次应用。蛋白质有很强的免疫原性，免疫动物可诱导产生高效价的抗体。从病原体中提取具有免疫保护作用的蛋白，或利用DNA重组技术使重组体表达蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗，称为亚单位疫苗。亚单位疫苗不含感染性组分，无须灭活，也无致病性。但也有研究表明，某些病原体亚单位疫苗的免疫原性低，不能达到满意的免疫保护作用。近年有研究显示，采用prime．boost方法将不同疫苗联合中文摘要应用能明显提高免疫效果。本研究采用pr

3、ime．boost方法将CVB3重组腺病毒Ad／vpl与CVB3／VPlDNA疫苗或CVB3VPl蛋白疫苗联合应用免疫小鼠，观察免疫效果。方法：1将我室前期构建的原核表达质粒pET-his／VPl转入表达宿主菌BL2I(DE3)pLysS，诱导表达携带有6×HIS标签的VPl蛋白，分别利用HIS单抗和CVB3多抗经Western．blot鉴定无误后对目的蛋白进行优化表达。将大量诱导表达的菌体在冰浴中超声破碎，分离上清和包涵体沉淀，对该蛋白的水溶性进行分析。将包涵体溶液经金属镍离子基质亲和层析柱纯化，获得纯化的蛋白。2用碱裂解法从转化的DH5a大肠杆菌中大量提取质粒pcDN

4、A3／VPl，用聚乙二醇沉淀法进行纯化。3将本室前期构建的Ad／vpl第三代病毒液感染293细胞，逐日观察细胞病变，待80％的细胞出现病变后，收集细胞和培养液，用GENMED腺病毒沉淀法纯化试剂盒纯化。4动物实验：将6～8周龄雄性BALB／c小鼠随机分为(1)～(8)组，每组18只。分别为(1)PBS组：肌肉注射PBS，每3周1次，共3次；(2)质粒组：肌肉注射pcDNA3／VPl，每3周1次，共3次；(3)腺病毒组：肌肉注射Ad／vpl，每3周1次，共2次：(4)质粒／腺病毒组：第1、2次注射pcDNA3／VPl，第3次注射Ad／vpl，各次间隔3周；(5)腺病毒／质粒

5、组：第1次注射Ad／vpl，第2、3次注射pcDNA3／VPl，各次间隔3周；(6)蛋白／腺病毒组：第1、2次注射VPl蛋白，第3次注射Ad／vpl，各次间隔3周；(7)腺病毒／蛋白组：第1次注射Ad／vpl，第2、3次注射VPl蛋白，各次间隔3周；(8)蛋白组：每3周注射1次，共3次。质粒采用股四头肌接种，接种前注射25％高渗中文摘要蔗糖溶液100p1，20min后原位注射质粒100pg／100}tl；VPl蛋白以PBS稀释后，采用肌肉注射免疫，每次接种100pg／只。初次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂；重组腺病毒Ad／vpl以PBS稀释，每次肌肉接种4×

6、107pfu／只。每次免疫后第14天，内眦静脉取血，分离血清，用微量中和试验检测血清CVB3特异性中和抗体，用ELISA检测IgG抗体；第三次免疫后3周，每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液，采用细胞计数试剂盒(cellcountingkit．8，CCK一8)法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，can_0杀伤活性的检测；另每组12只小鼠用致死量的CVB3(4．5LD50)进行腹腔注射，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天；每组剩余的3只小鼠用3LD，oCVB3攻击，注射病毒后第7天采血，测定血中病毒滴度。结果：

7、1酶切鉴定结果证实成功提取了真核表达重组质粒pcDNA3／VPl。2在大肠杆菌BL2I(DE3)pLysS中成功表达了CVB3VPl蛋白，表达蛋白主要以包涵体形式存在。3用293细胞大量扩增了重组腺病毒并进行了纯化。4每次免疫后14天，取血，测各组血清中和抗体的平均效价分别为：PBS对照组未检测到；pcDNA3／VPl质粒组1：5．30，1：17．82，1：23．78；腺病毒组1：5．61，1：15．87；质粒／腺病毒组1：5．30，1：17．82，1：29．96；腺病毒／质粒组1：5．61，1：17．82，1：28．28；蛋