壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价

《壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价?830?[文章编号]1000—4718(2005)04—0830—03中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiolob,)’一!!21?实验技术?壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价*张艳玲2,刘然义,柯妙拉,陈

2、洁敏,李晓红,叶春玲,黄文林(?中山大学附属肿瘤医院619室,广东广州510059;暨南大学药学院药理学教研室,广东广州510632)[摘要】目的:介绍壳蛋自免疫法hexoninmaunoassay),并同传统细胞病变(c陋)法比较,检测其可靠性和可重复性.方法:3种重组腺病毒(Ad—lacz,Ad—hEndo和d/1520)扩增,提纯后,用壳蛋白免疫法,CPE法测定病毒滴度及Az6o值法测定病毒总颗粒数.结果:壳蛋白免疫法和CPE法同时测定3种同批次病毒滴度,结果一致,P>0.05:对不

3、同批次3种腺病毒滴度测定,结果仍相似,平均差值牙±S=0.1527±0.3270,P>0.05,两法有很好的相关性,r=0.913;壳蛋白免疫法对同批d/1520测定19次,变异系数仅为1.42%.结论:壳蛋白免疫法是测定腺病毒滴度的有效方法,系统误差小,重复性好,结果客观可靠,可避免CPE法中由于细胞退化和工作人员主观判断造成的系统误差,比CPE法更精确,更省时.[关键词]腺病毒;壳蛋白免疫测定[KEYWORDS]Adenovirus;Hexoninanunoassay[中图分类号]R3

4、63[文献标识码]A重组腺病毒在基因治疗领域中具有广阔应用前景.已在囊性纤维化和癌症基因治疗中作为目的基因载体,如成胶质细胞瘤,成神经细胞瘤,黑色素瘤以及恶性乳腺癌,结肠癌,头颈癌,肝癌等LlJ.随着腺病毒载体广泛应用,急待建立快速准确的腺病毒滴度测定方法.目前有许多测定重组腺病毒滴度的方法,如荧光法,A26o法,细胞病变(cpE)法和空斑法L2J.传统的腺病毒滴度测定方法包括作用于单层细胞的CPE法和空斑法,均属于生物学方法,需要10—14d甚至更多的时问.A260法是一种物理学方法,仅耗时约

5、1h,但测定的是病毒DNA和蛋白质总浓度,无法区分有感染作用和无感染作用的病毒颗粒.通过检测293细胞中病毒六联体壳蛋白的特异性反应可定量测定具有感染活性的病毒颗粒,耗时约52h.其结果同标准CPE法有一定的可比性,但比CPE法省时问.材料和方法1细胞培养整合有腺病毒E1区基因的永生化人胚肾细胞系293细胞,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养.2病毒重组腺病毒152o,Ad—hEndo,Ad—lacz在293细胞中扩增,然后用氯化铯密度梯度法纯化.纯化后的病毒保存于一80℃.3劫法梯度稀

6、释病毒(50病毒+450溶剂),测260nln吸光值.最后计算病毒滴度:腺病毒颗粒/mL=A值×稀释倍数×1012[.4壳蛋白免疫法首先按10倍梯度稀释病毒,准备10..一10I76个稀释度的病毒.然后用293细胞铺12孔培养板,不必细胞贴壁,直接加入同体积各稀释度病毒.37℃培养48h.第3d,用抗壳蛋白抗体,共轭辣根过氧化物酶二抗和DAB进行免疫组化染色.被感染的细胞呈褐色,很容易与非感染细胞区分.病毒滴度通过计数特定区域中阳性细胞数获得,以感染单位/mL(WU/mL)表示,每个被染色的细胞

7、对应一个感染单位(IFU).r~(IFU/mL)=一(i.nfectevidmscell(smL/fie)ld×)(x…(fie.1ds/wel1)vOltllnedilutionmctorjVlms,mLJ×～5CPE法用293细胞(每孔lO4个)种96孔板,培养约24h,细胞贴壁并形成均匀单层.准备10～一109个稀释度的病毒,每:tL~ll50止病毒,每列一个稀释度,共9列.余下3列加入培养液,作为空白对照.然后在37℃,5%C02培养10d.每天显微镜下观察细胞病变情况.记录每一列病变情

8、况,用Reed—Much公式【4J计算.6统计学处理所有数据以牙±S表示,结果用双测Student’St检验比较差异显着性.结果1A260法测得3个重组腺病毒Ad—lacz,Ad—hEndo,d/1520的总病毒颗粒数分别是(1.820士0.o9o)x10VP/mI,,(3.390±0.007)×102vP/rrlL,(2.340±0.002)×102vP/rrlL.2CPE法和壳蛋白免疫法细胞形态学观察由于CPE法和壳蛋白免疫法都是靠眼睛计数,所以形态[收稿El期]2003—09—04[修回E