农杆菌介导的苜蓿耐盐SOS多基因遗传转化研究

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1、分类号：Ｓ３３２单位代码：１０７４９密级１２０１３１４００３０：公开学号：宁夏大学博士学位论文农杆菌介导的苜宿耐盐多基因遗传转化研究Ａｒｏｂａｃｔｅｒｕｍｍｅａｃｅｎｓ－ｍｅｄａｅｄａｎｓｆｏｒｍａｈｇｉｔｕ／ｉｉｔＴｒｔｉｏｎｗｉｔ－ｏｅｒａｎＳａｌｔｔｌｔＳＯＳｅｎｅｓｉｎＡｌｆａｌｆａｇ学位申请人：王静指导教师：许兴教授申请学位门类级别：农学博士专业名称：草学研究方向：牧草牛理生态学与饲草栽培所在学院：农学院论文完成日期：２０１８年５月

2、独创性声明Ｉ本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使一用过的材料。与我同工作的老师、同学、朋友对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：时间：》年Ｇ月２曰＞１关于论文使用授权的说明本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定：，即学校有权保留送交，，可以采用影印论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅、缩印

3、或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）＜＾日研宂生签名：２〇：％时间讼年月＜厶０’导师签名：：时间ｒ年《月，日，ＩＩ摘要一首蓿（Ｍｅｄ／ｃａｏｓａｔＶｆｌＬ．）是全世界分布最广的种多年生豆科牧草，也是我国畜牧业生产ｇ中的重要词草饲料，具有产量高，营养价值丰富，氨基酸组成均衡，畜禽均喜食等特性。随着生态文明建设和现代草畜产业发展，迫切需求节水抗旱和耐盐苜蓿新品种。利用分子育种手段是加快培育苜蓿耐盐

4、新品种的有效途径。ＳＯＳ（ＳａｌｔＯｖｅｒｌｙＳｅｎｓｉｔｉｖｅ，ＳＯＳ）家族基因具有调控离子平衡作用，己在拟南芥，、水稻、烟草和草坪草等植物中验证具有提高耐盐性功能但目前应用该家族基因进行苜蓿耐盐性改良报道较少。本研究基于苜蓿高频再生体系的建立，优化了农杆菌介导的ＳＯＳ家族多基因（ＳＣＷ２和ＳＯ幻）遗传转化体系，获得了耐盐转基因株系，并在室内和田间进行了耐盐性鉴定和评价：。主要结果如下“．通过愈伤组织和子叶节离体培养１，构建了高频的愈伤组织再生体系和子叶节再生体系。以杰”“”“”“”“”“”“”“”克林、阿尔冈金、金皇后

5、１、金皇后２、皇后２０００、柏拉图、三得利、甘农３号、“”“”敖汉和陇东１０个苜蓿品种为研究对象，对其愈伤组织诱导分化，不定芽诱导伸长和生根“杰克林”等影响因素进行了系统研宄，研究表明下胚轴愈伤组织诱导率高达］００％，分化率高“”达６９，．７５％；金皇后２子叶节不定芽诱导率达７６％分化率达７１％；生根率高达９６％？２．探讨了影响农杆菌介导的苜蓿胚性愈伤组织遗传转化的因素，优化了苜蓿多基因遗传转化体＇１－系。在农杆菌介导苜蓿多基因遗传转化中，１００ｘｍｏｌｉ的乙酰丁香酮可使转化率提髙２３倍ｆ；最佳菌液侵染０￡）？？值在０

6、．６；最适侵染时间为２０ｍｉｎ；头孢霉素作为最佳除菌剂其最适浓度为５００ｍｌ１Ｇｌ１；筛选剂ｌｕ最适选择压为５．０ｍ；后期培养可适当降低除菌剂和筛选剂的浓度ｇｇ。的－３、，．对获得１２株除草剂抗性植株进行ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交及ＲＴＰＣＲ分子检测阳性植株５株，＊，且沉汉５基因和基因已经在转录水平上表达证明外源多基因己经整合到苜蓿的基因组之中。－对获得的转基因株系Ｔ２－１采用嫩枝扦插技术进行盆栽无性扩繁，获得了６０株转基因Ｔ２１株系群体材料。４－，证明转基因株系较野生型具有明显的．对获得的转基因株系Ｔ２］进行了室内盆栽

7、耐盐性鉴定－耐盐性。采用０、１００、２００和３００ｍＭＮａＣｌ８ｄ后，转基因株系Ｔ２１的表型胁迫处理、株高、＋＋叶绿素２、叶面积、鲜草产量、茎粗和分枝数等农艺性状均优于野生型对照；叶片Ｋ、Ｃａ和Ｐｒｏ＋含量及ＳＯＤ、ＰＯＤ和ＣＡＴ酶活性增加并高于野生型对照，Ｎａ积累量、ＭＤＡ含量和相对电导率均低于野生型对照－。结果表明，转基因Ｔ２１株系的抗氧化保护酶活性增加，清除了活性氧伤害；渗透调节物质积累增加，提高了渗透调节能力，维持了膜结构稳定，；膜脂过氧化程度较低这可＋＋＋能是由于沉石途径基因的表达调控将Ｎａ排出胞外，选择性吸收更多的Ｋ，维

8、持细胞内Ｎａ和＋的动态平衡，毒害，从而提高转基因苜蓿的耐盐性减轻Ｎａ。－