拟南芥亲免蛋白CYP26-2功能初探及一个糖敏感型突变体基因定位与表型鉴定

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1、类号：Q2学校代码：10697密级：公开学号：201520866硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION拟南芥亲免蛋白CYP26-2功能初探及一个糖敏感型突变体基因定位与表型鉴定学科名称：细胞生物学作者：于小霞指导老师：王玉华副教授西北大学学位评定委员会二〇一八年ExploringphysiologicalrolesofCYP26-2andasugar-sensitivemutantgenemappingandphenotypeidentificationinArabidopsistha

2、lianaAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinBioengineeringByYuXiaoxiaSupervisor:YuhuaWangAssociateProfessorMay2018摘要亲免蛋白（Immunophilins）是最初在动物体内发现的免疫抑制药物在细胞内的受体，根据其结合的配体的不同主要分为CYPs（cyclophilins,CY

3、Ps）和FKBPs（FK-506bindingproteins，FKBPs）两大家族。亲免蛋白广泛存在各个生物体中，包括细菌、真菌、动物和植物。研究表明，亲免蛋白在植物中的数量最多。拟南芥基因组总共编码了52个亲免蛋白，其中有17个定位于叶绿体中，这表明叶绿体是包含亲免蛋白最多的细胞器。据文献报道，拟南芥叶绿体中的17个亲免蛋白中只有一个存在于基质中，其余的16个均定位于类囊体腔中。类囊体膜是绿色植物光合大分子组装的场所，那么数量最多的亲免蛋白是否也参与了光合大分子的形成呢。已有报道拟南芥类囊体腔中

4、的一个亲免蛋白CYP38对PSII的正确组装及稳定性维持具有重要的作用，此项研究为亲免蛋白参与光合作用供了依据。CYP26-2也是类囊体腔中的亲免蛋白之一，分子量大小为26KD，那么该蛋白是否也参与了光合作用的过程，目前对于这方面还没有确切的研究。本文主要对CYP26-2是否参与了光合作用的基本过程这一核心问题进行初步的探究。首先使用蓝色活性胶技术与蔗糖密度梯度离心技术分离CYP26-2-HA转基因植株类囊体膜上的大分子复合体，并且结合WesternBlotting检测CYP26-2对应的位置，初步

5、了该蛋白是否参与了大分子复合体的组装，接着通过T-DNA插入突变的筛选和CRISPR-Cas9系统获得CYP26-2的缺失突变体，通过对缺突变体的研究进一步了解CYP26-2在植物体内的生理功能。最终，我们发现WesternBlotting检测到的CYP26-2信号对应于活性胶及蔗糖密度梯度离心分离CYP26-2-HA类囊体膜结果中的PSⅡ，LHCII等复合体的位置，据此初步推测CYP26-2蛋白可能参与了光合作用的过程。进一步应用该基因的缺失突变体对其功能进行探究，通过筛获得两个株系的T-DNA插

6、入纯合突变体，但突变体的T-DNA插入位点都在3’UTR区，CYP26-2基因的转录并没有完全沉默。为了更好的探究该基因的功能，我们构建了多位点靶向CYP26-2基因的CRISPR-Cas9双元载体，并将其成功转入野生型拟南芥中，通过筛选得到两种CYP26-2的纯合并且不含T-DNA的突变体，分别标记为66#和19#，经过I分子水平的鉴定确定它们都是CYP26-2的缺失突变体，但是两种突变体在正常光照以及高光条件下与野生型相比都并没有差异，据此我们推测CYP26-2在拟南芥中的功能是冗余的。在利用C

7、RISPR-Cas9系统筛选突变体的过程中，我们得到了一个具有明显突变表型的株系，经鉴定该植株是由CRISPR-Cas9系统脱靶产生的新突变体。利用图位克隆技术对该基因进行作图分析，最终将突变基因定位于4号染色体的4G3与4G8两个分子标记之间，间距为400kb。分别对突变体植株在土壤及蔗糖梯度培养基中的表型进行观察，结果发现不管在土壤还是在无糖培养基中突变体真叶呈现黄色，对光极度敏感，只能在低光下生长，当培养基中蔗糖浓度增加到3%时，突变体植株的子叶也会变成黄色，这说明突变体对蔗糖比较敏感，因此将

8、该突变体命名为糖敏感型突变体。关键词：CYP26-2，CRISPR-Cas9，蓝色活性胶，蔗糖梯度离心，图位克隆IIAbstractImmunophilins,asreceptorsforimmunosuppressivedrugs,areoriginallyfoundinanimals.Theyareclassifiedintotwomajorfamilies(accordingtotheirimmunosuppressantligandpartners):theF