基于螺吡喃分子开关的比率型溶酶体pH荧光探针的构建及生物应用研究

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1、RatiometricfluorescentprobesforlysosomalpHmeasurementbasedonspiropyranmolecularswitchesandtheirbiologicalapplicationAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinOrganicChemistry摘要摘要溶酶体是细胞内关键的亚细胞器，其微环境的pH值处于4.5~5.5，由于自身的酸性环境，溶酶体常参与细胞

2、代谢、细胞膜循环、细胞自噬、细胞自清理、细胞凋亡等生理过程。近几年的科学研究发现，癌细胞中溶酶体的数量较正常细胞多、体积偏大，而且当癌细胞溶酶体释放组织蛋白酶至细胞质中，会促进肿瘤细胞的发展。因此，溶酶体已成为选择性破坏癌细胞的药理学靶点。所以，实现对溶酶体的精准定位和其内部的pH检测，不仅能够帮助理解溶酶体的生理功能，而且还能为癌症的诊疗提供全新的思路。目前，基于荧光分析法的灵敏度高、操作简便、实时成像和无创性等特点，一些优秀的靶向溶酶体及检测溶酶体pH的荧光探针已相继报道。其中，比率型荧光探针可通过两个发射波长自校准来避免背景干扰，在精准荧光成像方面具有优

3、势。所以比率型检测溶酶体pH成为该领域的研究热点。螺吡喃类荧光分子一般被用作光动力传感器，然而除了光照作用，酸碱也能调控其开-关环的转化。在酸性条件下，螺吡喃的碳-氧键易被质子化，形成π-延伸共轭的开环体部花菁形式，从而发生荧光信号的变化。基于这种原理，本文设计合成了一类香豆素螺吡喃的比率型溶酶体pH荧光探针HAN1、HAN2、HAN3和HAN4。本文研究了这类探针的pH特性、干扰性和光稳定性能，结果表明，这四种pH敏感的探针在pH4.0-7.0之间可发生开环现象，同时荧光从蓝色变为红色，且不受阴、阳离子和光的影响。通过共定位实验发现这四种探针展现出较好的生物

4、相容性和光稳定性，并成功实现了在活细胞中靶向溶酶体。本文还将HAN1和HAN3应用于氯喹宁诱导溶酶体pH升高的成像研究，结果发现的确能够实现蓝通道荧光增强且红通道荧光减弱的比率型变化。因此，成功实现了溶酶体中比率型pH的检测及溶酶体pH变化的实时监测。同时，还进一步进行了探针应用于溶酶体热损伤前后pH变化的荧光成像研究，也获得了相同的结果，即蓝通道荧光增强，红通道荧光减弱，说明随着温度的升高，溶酶体pH逐渐升高。本文开发了一类可实时、精准检测活细胞内溶酶体活动的荧光探针，为比率型溶酶体pH荧光探针提供了一种新的设计思路。关键词：比率型荧光探针；螺吡喃衍生物；溶

5、酶体pH；细胞成像；热损伤IAbstractAbstractLysosomeisanimportantsubcellularorganelleincells.TherangeoflysosomepHisfrom4.5to5.5.Duetoitsacidicenvironment,lysosomeplaysanimportantroleinintracellularlysosomalmetabolism,cellcycle,cellautophagy,cellmembraneself-cleaningandapoptosis.However,therecents

6、tudiessuggesttheappearanceoflysosomesincancercellsisdifferentfromthoseinnormalcells,whicharelargerandmoreirregular.Andthereleaseofcathepsinsfromcancer-celllysosomesintotheextracellularspacecanpromotetumourprogression,whichmakeslysosomebecomeananticancertarget.Therefore,theclearvisua

7、lizationoflysosomesanddetectionofpHcannotonlybeconducivetocomprehendthephysiologicalfunctionsoflysosomes,butalsoprovidenewstrategyforthediagnosisandtreatmentofcancer.Currently,someexcellentlysosome-targetedfluorescentprobesfordetectinglysosomepHhavebeenreportedowingtotheirhandyopera

8、tion,noninvasivenes