涵蛋白O在软骨分化中的作用与机制

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1、分类号：Q95学校代码：10697密级：公开学号：201520835硒蛋白O在软骨分化中的作用与机制学科名称：动物学作者：费瑶指导老师：于海丽副教授西北大学学位评定委员会二〇一八年三月TherolesandmolecularmechanismsoftheselenoproteinOincartilagedevelopmentAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinZoologyByFeiYaoSupervisor:YuHailiA

2、ssociateProfessor2018摘要西北大学硕士学位论文摘要摘要硒（Selenium,Se）是机体内不可或缺的必需微量元素。通常，硒在膳食中以各种形式存在，被机体摄取以后，在细胞内活化成硒酸，进而通过共翻译机制合成硒代半胱氨酸，随后整合至肽链，并入硒蛋白后在机体发挥生物学作用。所有含硒代半胱氨酸的蛋白质被称为硒蛋白(Selenoprotein,Sel)，目前已知的硒蛋白家族有30种，其中鱼类最多,有30种，啮齿类24种，人类基因组中有25种硒蛋白，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPx1-4，而GPx6仅在人类基因中含硒）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR1-3）、脱碘酶（DIO1-

3、3）、磷酸硒合成酶2（SPS2）、Sep15、SelH、SelI、SelK、SelM、SelN、SelO、SelP、SelR、SelS、SelT、SelV、SelW等。而其中大部分功能已有所了解，都参加细胞内氧化还原酶反应，而硒蛋白O(SelO)作为哺乳动物体内最大的硒蛋白，其功能及其确切作用机制尚不完全清楚。同时SelO作为人类基因组计划执行以来，少数功能未知的蛋白之一，其功能也值得探究。硒与硒蛋白与人类健康息息相关，有研究发现在中国硒缺乏地带会出现骨发育障碍疾病，因此硒缺乏可能是软骨发育障碍的一个可能致病因素。因此，本研究旨在观察SelO在软骨发育过程中的作用及其分子作用机制

4、。首先，我们观察了SelO在软骨组织中的表达，通过HE染色和免疫组化试验发现，SelO在生长板软骨组织中的肥大区高度表达。另外在细胞层面，我们诱导成软骨细胞分化，并收集分化不同时间点的细胞总蛋白，通过WB试验检测SelO的表达；结果显示SelO在成软骨细胞诱导分化过程中持续表达。以上两部分试验证明，SelO在软骨组织有表达。其次，我们设计干扰试验干扰SelO的表达，观察SelO在软骨发育中的作用。在软骨组织层面，我们对小鼠胫骨进行离体培养，通过慢病毒干扰SelO在胫骨中的表达，结果显示，干扰SelO会导致小鼠胫骨发育不良，生长板结构异常；随后通过阿辛蓝和稀素红分别对胫骨中软骨和骨

5、的部分进行染色后发现，干扰SelO主要是抑制的胫骨组织中生长板软骨部分的发育障碍，进一步对生长板软骨进行HE染色发现，干扰SelO会抑制生长板软骨中静息区、增殖区、前肥大区、肥大区各部分组织生长，同时还导致肥大区结构异常。而在细胞层面，我们通过微团培养软骨细胞分化模型，通过SelO特异性靶shRNA干扰SelO表达后发现，干扰SelO会导致软骨细胞基质中标记软骨形成的蛋白聚糖（GAGs）的积累减少，碱性磷酸酶（ALP）的活性显著降低。而另外我们收集细胞总蛋白通过WB试验发现，干扰SelO会抑制软骨形成的标志基因Sox9，ColIII西北大学硕士学位论文和软骨聚糖蛋白Aggreca

6、n的表达，以上结果证明：干扰SelO表达后，抑制了软骨细胞的分化，导致软骨组织中各区域的生长减缓，进而导致软骨发育不良，胫骨生长障碍。而细胞分化是以细胞增殖为基础，所以我们又进一步通过MTT比色法测定细胞活力，发现干扰SelO，细胞活力明显下降。而细胞增殖是影响细胞活力的重要因素，因此，我们通过细胞流式技术分析了细胞周期进程，发现干扰SelO会导致细胞G0/G1明显增多，细胞周期延长。同时WB试验结果证明，干扰SelO会导致细胞周期蛋白CycinD1表达降低，两部分试验结果证明：干扰SelO导致细胞周期进程延缓，进而抑制了软骨细胞增殖。另外，细胞活力的降低也有细胞死亡的因素，所以

7、我们进一步通过LDH细胞毒性检测细胞的死亡，发现干扰SelO后软骨细胞死亡明显增多。进一步的AnnexinV-PI双标记染色法结果证明，干扰SelO后，细胞凋亡增加。同时WB试验结果证明，干扰SelO后Caspase-3活化增加，Caspase-3凋亡通路活化。试验结果显示干扰SelO后能够诱导细胞凋亡进而导致软骨细胞死亡，从而使得细胞活力降低。最后，明确SelO在软骨分化发育中的重要作用之后，我们进一步探究SelO发挥作用的分子机制。结合已知的硒蛋白大都参与细胞氧化还原酶反应这