灰盖鬼伞菌柄细胞壁伸长生长的分子生物学机制研究

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1、施Ｉｓｌ灰盖鬼伞菌柄细胞壁伸长生长的分子生物学机制研究研宄生：周降生指导教师：袁生教授培养单位：生命科学学院一级学科：生物学二级学科：微生物学完成时间：２０１８年３月２８日答辩时间：２０１８年５月２２日学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作和取得的研宄成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构己经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研宄

2、所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名－：灰日期：以戌ｕ辑学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范大学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。（保密论文在解密后遵守此规定）学位论文作者签名：艾指导教师签名：Ａ日期：兔认域日期：ｍｍ摘要担

3、子菌子实体菌柄的生长表现为特征性的伸长生长，这主要取决于细胞壁数倍的伸长生长而非细胞的分裂。担子菌菌柄细胞壁主要由几丁质微丝与葡聚糖共，并包裹于细胞质膜外价交联而成。细胞壁在伸长生长时，既要提供足够的强度一抵抗膨压的机械力以维持细胞形状，同时又要具有定的可塑性，以使新的细胞壁组分能够在膨压的作用下填充到细胞壁基质来扩大细胞壁表面积。早期研究者认为菌柄细胞壁伸长主要是酶水解细胞壁多糖基质导致的，研究认为菌柄细胞壁初始是由几丁质和葡聚糖交联形成的刚性结构，这些交联能在水解酶的作用下持续被破坏和重构

4、以实现菌柄的伸长，因此后。但由于缺乏直接的证据证明其假说来研宄者又提出了初期菌柄细胞壁是可塑的，葡聚糖链间的氢键能在膨压的作用下被持续的破坏和重构，并造成几丁质链的相对滑行实现细胞壁的扩张。也有研宄者认为真菌细胞壁的扩张类似于植物，能够在伸长蛋白的作用下导致葡聚糖和几丁质链间的氢键被持续的破坏和重构，并在膨压的作用下使新的细胞壁组分得以插入，这几种理论都没有直接的证据加以，从而实现细胞壁的伸长生长。然而一，对步研宄证明。因此于真菌细胞壁伸长生长的机制仍有待进。本论文以灰盖鬼伞为研宄对象，首先从

5、菌柄顶端快速伸长区分离纯化细胞壁蛋白，以期获得内源性伸长活性蛋白。但研究发现菌柄细胞壁伸长活性蛋白含量较低，而无法分离纯化到。然后从伞盖分离纯化伸长活性蛋白时，同样发现其含量较低而导致实验失败。有趣的是，在分离纯化伸长活性蛋白过程中发现恢复热灭活菌柄细胞壁重构伸长的活性一直伴随着葡聚糖水解酶和几丁质水解酶的活一Ｎ－步研宄发现，菌柄细胞壁在酸伸长过程中能够释放葡萄糖乙酰氨基性。进、葡萄糖和几丁质二糖，而这些寡糖分别是葡聚糖酶和几丁质酶水解细胞壁基质的水解产物，释放了和未灭活细胞。菌柄细胞壁蛋

6、白在恢复热灭活菌柄重构伸长时壁酸伸长等量的几丁质寡糖，而葡萄糖的量则明显减少。说明几丁质酶在细胞壁的重构中尤为重要，通过分离纯化或是异源重组表达的方法获得了几丁质。因此酶家族的８个全部几丁质酶。并对其中的ＣｈｉＥｌ和Ｃｈ正ｎ３的酶学性质作了重点研宄，研宄发现Ｃｈ正１为能够水解不溶性底物微晶几丁质粉末的进程式外切几丁质酶，而ＣｈｉＥｎ３则为不能水解不溶性底物微晶几丁质粉末的外切几丁质酶。通过对８个几丁质酶的伸长活性检测发现，仅有Ｃｈ正１和Ｃｈｉｌｌｉ对热灭活菌，也仅有Ｃｈ正１和Ｃｈ柄具有重构伸长活性

7、。与其它几丁质酶相比ｉｌｌｉ对微晶几丁质粉末有水解活性，表明细胞壁中的微晶几丁质为Ｃｈ正１和Ｃｈｉｌｌｉ作用的靶点。研究发现ＣｈｉＥｌ和Ｃｈｉｌｌｉ恢复热灭活菌柄细胞壁重构伸长时类似于植物的Ｉｍｍｅｘｐａｎｓｉｎ蛋白，具有浓度依赖性、ｐＨ依赖性、伸长区域依赖性和物种选择性。且ＣｈｉＥｌ和Ｃｈｉｌｌｉ在恢复热灭活菌柄细胞壁重构伸长时最适ｐＨ均为４．５，与菌柄酸伸长最适ｐＨ相同，而与其水解最适ｐＨ５．０不同。可能是由于几丁质链中的－－ＨＮ．．．０在酸性条件下不稳定，更易于被破坏的原因。当Ｃ

8、ｈｉＥｌ和Ｃｈｉｌｌｉ协同作用时，能在较低的蛋白浓度范围内恢复热灭活菌柄细胞壁的重构伸长。基因转录和蛋白表达研宄发现，ＣｈｉＥｌ和Ｃｈｉｌｌｉ的表达水平与菌柄细胞壁的伸长生长密切相关ｌ。且氨基酸序列结构预测和胶体金定位分别表明ＣｈｉＥ和Ｃｈｉｌｌｉ能够绑定于细胞壁上，并参与细胞壁的重构。当单独沉默Ｃｈ