特异性小肽亲和整体柱对单抗药的富集纯化策略研究

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1、暨南大学硕士学位论文题名(中英对照)：特异性小肽亲和整体柱对单抗药的富集纯化策略研究Specificsmallpeptidesfunctionalizedaffinitymonolithforenrichmentandpurificationofmonoclonalantibodydrugs作者姓名：王祥宇指导教师姓名韩海及学位、职称：博士副教授学科、专业名称：药物分析学学位类型：学术学位论文提交日期：论文答辩日期：2018年月日答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：暨南大学年月日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除

2、了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：2018年6月21日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本

3、授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：2018年6月21日签字日期：2018年6月21日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：暨南大学硕士学位论文特异性小肽亲和整体柱对单抗药的富集纯化策略研究摘要随着单克隆抗体药物在药学、治疗学和诊断学上的迅猛发展，发展单克隆抗体药物的富集纯化技术变得十分重要。目前使用最为广泛的是以蛋白质A为亲和配基的琼脂糖亲和色谱，虽然该方法特异性强，但是配基存在成本高、稳定性差、配基易脱落、易降解、对pH敏感、寿命短等缺点，同时，琼脂糖基质导致的非特异性吸附也为后续的纯化分析带来极大的困难。小肽配基价格低廉、化学性质稳定、生物相容性好

4、、洗脱条件非常温和、使用寿命长，是替代蛋白质A的最佳候选者之一。另一方面，有机聚合物整体色谱柱的基质是由原位聚合得到的聚合物，具有孔隙度高、比表面积大、表面易修饰、耐酸碱性好等优点，更重要的是通过改变交联剂的种类可以显著降低材料表面的非特异性吸附。本文的研究重点就是将小肽配基与有机聚合物整体材料相互结合，使用不同的制备方案，充分利用两者各自的优势，将其用于单克隆抗体药物的富集纯化。同时结合小肽配基的研究现状，对小肽亲和整体柱在单抗药物富集纯化方面的应用潜力、发展方向进行了展望。第一章，系统介绍了蛋白纯化技术的分类及发展现状和小肽配基亲和纯化策略研究概况，并对其在单抗药物富集纯

5、化中的应用研究进行了详细研讨，探讨了小肽配基与整体材料相结合的优势。同时总结了常见的两大类制备方法对整体柱色谱性能的影响及各自带来的优缺点，并在此基础上提出了本论文的研究思路、实验方案及创新点。第二章，His-tag-DAAG被设计作为亲和配基，首次利用金属螯合多步法制备取得DAAG功能化亲和整体柱，该制备方法首先以甲基丙烯酸缩甘油酯（GMA）作为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）作为交联剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，水、异丙醇和1，4-丁二醇作为三元生孔体系，制备取得基质整体柱poly(GMA-co-EDMA)；然后，利用开环反应，将螯合剂N,N-双(羧甲基)-

6、L-赖氨酸（ANTA）固定于材料表面；接着，硫酸镍灌柱获得固定化镍离子亲和整体柱；最后，将修饰后的小肽配基His-tag-DAAG以金属螯合的方式固定于整体柱，获得DAAG功能化亲和整体柱。扫描电镜（SEM）、元素分析、X射线冷谱（EDS）、荧光显微镜、热重分析（TGA）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、压汞法、氮气吸附法和液相色谱等手段被运用进行材料表征。I暨南大学硕士学位论文特异性小肽亲和整体柱对单抗药的富集纯化策略研究第三章，对金属螯合多步法制备获得的DAAG功能化亲和整体柱的亲和能力进行了系统考察。通过对七种不同蛋白的色谱保留行为的研究，发现DAAG功能化亲和整体柱比传

7、统的固定化金属亲和整体柱特异性更强；通过前沿色谱分析技术，在hIgG和牛血清蛋白不同浓度或不同测试流速条件下，获得了DAAG功能化亲和整体柱和固定化镍离子亲和整体柱各自的动态吸附容量，以此绘制吸附等温线，拟合得到亲和参数，并进行详细比较，所有结果都表明DAAG功能化亲和整体柱具有更强的特异性、选择性和吸附能力；经过20次的重生循环使用，前10次的动态吸附量保持稳定，说明该柱稳定性较好；为了考察其对实际样品的应用潜力，该整体柱被用于赫赛汀细胞培养液中赫赛汀和人类血清中IgG的富集纯化，并将各组分进行了聚丙