Spastin调控AMPA受体GluA1亚基的内化及其机制

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：Spastin调控AMPA受体GluA1亚基的内化及其机制MechanismofSpastininregulatingAMPAreceptorsubunitGluA1internalization作者姓名：蔡振彬指导教师姓名及学位、职称：林宏生教授博士生导师郭国庆教授博士生导师学科、专业名称：外科学学位类型：学术学位论文提交日期：2018年月论文答辩日期：2018年月答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：暨南大学硕士学位论文Spastin调控AMPA受体GluA1亚基的内化及

2、其机制中文摘要目的本研究主要探讨微管切割蛋白Spastin如何调控AMPA受体GluA1亚基的内化。材料与方法首先我们构建了Spastin及其截短片段的各种表达载体，用pulldown和Co-IP的实验方法，明确Spastin和GluA1存在相互作用及其具体结合部位；然后在海马神经元中观察Spastin和GluA1在神经元中树突及树突棘的共定位情况；接下来在GluA1-HEK293T稳定细胞株及海马神经中过表达SpastinWT，通过免疫荧光以及提取细胞膜蛋白观察TotalGluA1和SurfaceGluA1的表达变化，并

3、用全细胞膜片钳记录AMPA电流和mEPSC的变化；最后构建Spastin功能域的真核表达突变体，在稳定细胞株和海马神经元中过表达，明确SpastinWT及其各功能域对GluA1的具体影响。结果1）通过pulldown和Co-IP实验中明确Spastin与GluA1存在相互作用，且作用部位位于Spastin的MIT功能域和GluA1的C末端；2）GluA1-HEK293T稳定细胞株及神经元中过表达SpastinWT，可抑制细胞膜GluA1的表达；3）SpastinWT及Spastin△MIT片段能够切割微管，而对照组、Spa

4、stin△MTBD、Spastin△AAA、SpastinC413Y片段则不能切割微管；4）稳定细胞株及神经元中过表达SpastinWT及其结构域突变体，切割微管功能及MIT结构共同促进GluA1内化。结论1）Spastin与GluA1存在相互作用，相互作用部位为Spastin的MIT功能域及GluA1的C末端；2）SpastinWT能促进GluA1的内化；3）Spastin的切割功能和MIT功能域共同促进GluA1内化。关键词：Spastin；GluA1；内化；微管切割；MIT功能域I暨南大学硕士学位论文Mechanis

5、mofSpastininregulatingAMPAreceptorsubunitGluA1internalizationABSTRACTObjectiveThestudyfocusedonhowthemicrotubule-severingproteinSpastinregulatetheinternalizationoftheGluA1subunitoftheAMPAreceptor.MaterialsandmethodsFirst,weconstructedthevariousexpressionvectorsofS

6、pastinanditstruncatedfragmentstoidentifytheinteractionandthebindingsitebetweenSpastinandGluA1byusingpulldownandCo-IP.Secondly,thecolocalizationofdendriteanddendriticspinewasobservedinhippocampalnruronwithSpastinandGluA1byLaserScanningConfocalMicroscope.Thirdly,Spa

7、stinwasoverexpressedinGluA1-293TstablecelllinesandhippocampalneuronstoobservethechangesofTotalGluA1andSurfaceGluA1byimmunofluorescence,membraneproteinextractionandpatchclamp.Atlast,theeukaryoticexpressionmutantsoftheSpastindomainswereconstructedandoverexpressedins

8、tablecelllinesandneuronstoclarifythespecificeffectsoftheSpastindomainswithGluA1.Results1)TheinteractionbetweenSpastinandGluA1wasconfirmedbypulldownandCo