基于环糊精改性的整体材料在蛋白质糖基化分析中的应用

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1、基于环糊精改性的整体材料在蛋白质糖基化分析中的应用PreparationofCyclodextrin-basedMonolithandApplicationinGlycoproteomics作者姓名：郑海娇专业名称：分析化学研究方向：复杂样品分离分析指导教师：贾琼教授学位类别：理学博士培养单位：吉林大学论文答辩日期：2018年6月4日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位盲审教授正高级中南大学主席郭黎平正高级东北师范大学盲审教授正高级华中科技大学委员苏星光正高级吉林大学盲

2、审教授正高级湖南大学张志权正高级吉林大学宋文波正高级吉林大学丁兰正高级吉林大学牛利正高级长春应化所基于环糊精改性的整体材料在蛋白质糖基化分析中的应用摘要作者：郑海娇指导教师：贾琼教授专业：分析化学蛋白质糖基化是研究蛋白质糖链组成及功能的一门学科。主要研究为寻找疾病相关蛋白糖基化修饰规律（糖链肽段结构与糖基化位点），分析糖蛋白糖链和糖结合蛋白相互作用的关联性，探讨糖类相关基因和糖结合蛋白基因调控糖蛋白糖链和糖结合蛋白合成的机制，具有十分重要的意义。质谱或色谱-质谱联用仪通常被作为研究糖蛋白及糖肽段的最有效方法。然而

3、，由于生物样本中糖基化蛋白质的相对丰度低、复杂程度高、动态范围宽，在质谱检测时，糖基化肽段的信号会严重受到高丰度非糖基化肽段的严重干扰。因此在质谱分析鉴定前，需要将糖基化蛋白质从复杂的生物样品中高效的分离富集。探索新的分离分析方法，解决复杂生物体系中低丰度糖基化蛋白质的分离富集是翻译后修饰蛋白质组学研究所面临的瓶颈问题。2006年，一种新型的管内固相微萃取样品预处理方法被发展出来，称为有机聚合物整体柱微萃取（polymermonolithmicroextraction,简称PMME），该技术以有机聚合物整体材料取

4、代传统的固相萃取小柱或涂层纤维，整体柱材料具备萃取容量大，负载能力强，聚合物表面具有丰富的有机基团有利于功能化，且具有很好的生物相容性等优点。近年来，PMME方法在质谱法测定糖蛋白或糖肽的前处理的众多方法中占有重要的一席之地。已报道的结果均表明，PMME方法具有萃取能力强、有机溶剂消耗少、耗时短等优势，在样品前处理步骤中起到消除大部分杂质干扰，纯化目标分析物的重要作用。β-环糊精（β-CD）是一类具有独特的呈立体锥形中空结构的环状低聚糖的简称，它们有较好的热稳定性，不易吸湿结块，在碱性介质中能够稳定存在。β-CD

5、最独特的性质为具备“外亲水，内疏水”的特征，其疏水腔可嵌入多种多II样的客体化合物，形成主-客体包结复合物。另外，β-CD外侧上端由C2和C3的仲羟基构成，下端由C6的伯羟基构成，使得β-CD外表面具有亲水性，与亲水客体分子间具有亲水作用力。由于β-CD的独特魅力，在分离富集等多重领域中被广泛应用。本论文利用β-CD独特的性质将其作为吸附材料，改性有机聚合物整体柱以提高萃取效率，制备出新型的整体材料集β-CD的优点和整体材料多通道、多孔性等性质于一体，将此类基于β-CD的整体柱制备成PMME装置与质谱仪器联用，用

6、于复杂生物样品中糖蛋白或糖肽的分离与检测。具体的实验内容分为以下四个部分：1.制备了糖簇（glycocluster）分子接枝的β-CD化合物（glycoβ-CD），再利用巯烯点击化学法将glycoβ-CD键合到聚（甲基丙烯酸羟乙酯-co-季戊四醇三丙烯酸酯）整体柱中，将此方法与质谱联用并富集检测复杂样品中的糖肽。考察了聚合物整体材料制备过程中各反应物最优化的比例。将所制备的最佳比例的聚合物制备成萃取装置，在最优化的萃取条件下，考察了所制备的改性后的聚合物整体柱在糖蛋白标准样品、糖蛋白与非糖蛋白混合样品与实际样品中

7、对糖肽的选择性。随后，采用人淋巴瘤细胞系（U937）裂解液为实际样品，考察了方法的灵敏度、稳定性和重现性，处理后的样品进行加标实验，测得回收率为（80.2±2.6）%（n=3）。2.制备了一种花生凝集素（PNA）改性的β-CD化合物，利用化学键合手段将PNA-β-CD化合物修饰到聚（甲基丙烯酸羟乙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）整体柱上，随后，将所制备的聚合物整体柱微萃取装置与质谱仪进样口连接进行在线解吸检测复杂样品中的半乳糖糖基化糖肽。考察了整体材料制备过程中各反应物的比例对聚合物形貌、通透性及溶胀效应的影响，

8、优化得到最佳的合成条件。随后，将整体柱制备成微萃取装置与结合质谱进行富集、清洗、排空和在线解吸步骤。实验中，尤其考察了在线解吸步骤的一系列条件。在最佳实验条件下，分别应用于检测血液样品和人急性髓系白血病细胞（Molm-13）样品中的半乳糖糖基化肽段。该方法的检出限为0.5fmol，整体柱批次与批间精密度分别为1.3%和4.2%，方法基质效应为（0.85–1.21）±0.0