凋亡蛋白酶依赖的氧化应激在人U251胶质瘤细胞中的作用和机制研究

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1、凋亡蛋白酶依赖的氧化应激在人U251胶质瘤细胞中的作用和机制研究Theactionsandmechanismsofcaspase-dependentoxidativestressinhumanU251gliomacells作者姓名：刘心睿专业名称：外科学指导教师：赵刚教授学位类别：医学博士论文答辩日期：2018年05月30日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席孙连坤教授吉林大学基础医学院委员吴安华教授中国医科大学附属第一医院李玉新教授东北师范大学生命科学院张文艳教授吉林大学第一医院所剑教授吉林大学第一医院许侃教授吉林大学第一医院中文摘要凋亡蛋

2、白酶依赖的氧化应激在人U251胶质瘤细胞中的作用和机制研究研究背景和意义胶质瘤是临床最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，瘤细胞的无限生长和侵袭浸润是其最大的生物学特征，也是患者预后不良的最主要原因。活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）是机体正常氧代谢的副产物。ROS和氧化应激对胶质瘤的关系极其复杂，尚未完全阐明。观察胶质瘤细胞中不同ROS及氧化应激水平下胶质瘤增殖、周期、凋亡的生物学效应，对于阐明胶质瘤的发病机制和寻找新的临床治疗策略具有重要意义。利用基因芯片技术和生物信息学分析方法，从全转录水平或全DNA层面了解胶质瘤细胞的基因表达情况，筛选

3、与胶质瘤疾病过程有关的基因表达集，为研究胶质瘤的发病机制、开发靶向性药物等提供了思路和线索。目的我们拟观察胶质瘤细胞中不同ROS及氧化应激水平对胶质瘤增殖、周期、凋亡等生物学效应的影响及机制，探索胶质瘤氧化应激水平和线粒体Caspase途径是否能作为胶质瘤治疗的潜在靶点。其次，我们分析了不同氧化应激状态下胶质瘤细胞全转录组水平的基因表达数据，从整体观察基因表达变化，筛选Caspsae3抑制剂影响的基因集，为寻找靶向治疗胶质瘤的方法和药物等提供新的研究方向和策略。方法首先，体外培养人胶质瘤U251细胞系，用H2O2处理后，分别采用流式细胞术检测细胞内ROS水平、细

4、胞周期和凋亡，四唑盐比色（MTT）法检测细胞增殖、免疫印迹法（Westernblot，WB）检测细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP的表达；接下来，对H2O2处理的胶质瘤U251细胞系加适当浓度的Caspase3抑制剂干预，分别采用流式细胞术检测细胞内ROS水平、细胞周期和凋I亡、MTT法检测细胞增殖、WB检测凋亡相关蛋白的表达。利用NOISeq软件包筛选Caspase3抑制剂在氧化应激状态下引起的胶质瘤细胞差异表达基因，对差异基因进行基因本体论（GeneOntology，GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（Kyot

5、oEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路富集分析和药物富集分析。使用String在线工具对得到的差异表达基因进行蛋白与蛋白相互作用（Protein-proteininteraction，PPI）关系预测，利用Cytoscape软件进行PPI网络图构建，使用cytoscape软件中的MCODE插件提取PPI网络中的子网络模块，对其进行功能分析；之后，利用webgestalt工具分别预测差异表达基因与微小RNA（microRNA，miRNA）和转录调控因子间的调控关系，并利用Cytoscape软件进行调控网络构建。结果（1）用超氧

6、化物银离子探针（Dihydroethidium，DHE）测定终浓度100μM、300μM、500μM的H.-）水平分别为（214.33±27.14）%、（589.522O2处理后的胶质瘤细胞内（O2±35.17）%和（643.28±31.54）%，均显著高于对照组（P<0.05）；且随着H2O2浓度的增加，细胞中(O2.-)水平逐渐升高（P<0.05）。（2）用终浓度为100μM、300μM、500μM的H2O2处理后的胶质瘤U251细胞存活率为分别为（82.57±5.34）%、（23.38±6.27）%和（18.21±3.11）%，H2O2浓度越高，胶质瘤细胞

7、存活率越低（P<0.05）；（3）100μM组、300μM、500μM组胶质瘤细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为（6.21±0.88）%和（10.71±0.42）%，（24.19±2.46）%和（19.59±2.33）%，（31.78±3.07）%和（37.18±4.20）%。H2O2浓度越高，细胞凋亡率越高（P<0.05）。其中100μM组胶质瘤细胞的凋亡率与对照组无显著差异（P>0.05），300μM、500μM组胶质瘤细胞的凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。（4）100μM组G1期、G2期和S期细胞分别占（28.79±3.64）%、（28.51±3.1

8、7）%和（46.67±2