miR-new14对猪不同基因型IGF-1的调控及其对PK-15细胞增殖和凋亡的影响

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1、wen-Rim分类号：Q522;Q786单位代码：10183研究生学号：2015882011密级：公开41对猪不同基1因-型FGI吉林大学的调控及5其硕士学位论文1对-KP（学术学位）细胞增miR-new14对猪不同基因型IGF-1的调控及其对PK-15细胞增殖和殖和凋凋亡的影响亡的RegulationofmiR-new14todifferentgenotypeofIGF-1geneinpigs影响anditseffectonproliferationandapoptosisofPK-15cells作者姓名：王刚王刚专业：生物化学与分子生物学研究方向：生物制药吉林指导教师：郝林琳大学培养单位：

2、动物科学学院miR-new14对猪不同基因型IGF-1的调控及其对PK-15细胞增殖和凋亡的影响RegulationofmiR-new14todifferentgenotypeofIGF-1geneinpigsanditseffectonproliferationandapoptosisofPK-15cells作者姓名：王刚专业名称：生物化学与分子生物学指导教师：郝林琳学位类别：理学硕士答辩日期：2018年6月4日本研究由“国家自然科学基金”（项目编号：31672514）资助SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.316725

3、14)中文摘要miR-new14对猪不同基因型IGF-1的调控及其对PK-15细胞增殖和凋亡的影响巴马香猪（BamaMinaturepigs）具有体型矮小，生长缓慢、生精周期短、产仔量较大等特点，在解剖学、生理学及遗传学等方面与人类相似，现已成为非啮齿类大型动物实验模型、人类疾病研究模型的物种，具有良好的生物医学应用前景。胰岛素样生长因子1（IGF-1）是影响动物生长和体型性状的重要候选基因之一，在调控猪矮小性状形成过程中发挥重要作用，因此研究调控IGF-1表达的相关因素的分子机制具有重要意义。本研究首先筛查了巴马香猪及作为对照的大白猪IGF-1基因3'UTR的SNP位点，并分析了其可能存在的

4、功能。结果发现，两猪种之间存在一处SNP位点（rs34142920,c.674C>T），其中T为大白猪优势等位基因，C为巴马香猪优势等位基因。通过在线软件对不同基因型IGF-1基因3'UTR序列进行mRNA二级结构预测，结果发现两者之间mRNA二级结构及最小自由能均存在差异。为了观察不同基因型3'UTR的基因表达是否存在差异，构建了两种携带IGF-1基因3'UTR（C/T）的双荧光素酶报告基因重组质粒，命名为psiCHECK-3'UTR-B与psiCHECK-3'UTR-L，并将其转染至PK-15细胞中，48h后检测荧光素酶活性。结果表明，与psiCHECK-3'UTR-L组相比，psiCHE

5、CK-3'UTR-B组的荧光素酶活性降低了27.86%（p<0.05）。为了进一步探究该SNP影响IGF-1表达量的分子机制，通过文献得知猪中存在的miR-new14的种子序列与IGF-1基因3'UTR互补配对，且该SNP位于miR-new14与IGF-1基因3'UTR结合区域。因此，为了验证miR-new14是否因与不同基因型IGF-1基因3'UTR结合差异影响基因表达，本实验将miR-new14/miR-new14NC与psiCHECK-3'UTR-B/psiCHECK-3'UTR-L双荧光素酶重组质粒共转染至PK-15细胞中，结果显示与miR-new14NC共转染组相比，miR-new1

6、4各共转染组的荧光素酶活性均受到抑制（p<0.05），且psiCHECK-3'UTR-B共转染组的荧光素酶活性受抑制程度显著高于psiCHECK-3'UTR-L共转染组（p<0.05），表明miR-new14对不同3'UTR基因型的IGF-1的表达影响存在差异。为了进一步观察miR-new14I是否能够调控内源性IGF-1基因的表达，本实验将miR-new14单独转染PK-15细胞，通过RT-qPCR和Western-Blot分别检测内源IGF-1mRNA与蛋白质表达量，发现与对照组相比，miR-new14组的IGF-1mRNA与蛋白质表达量均显著降低（p<0.05），表明miR-new14抑

7、制IGF-1转录和翻译水平。为了进一步明确miR-new14调控IGF-1表达进而对细胞增殖与凋亡的影响及其机制，本研究将miR-new14转染PK-15细胞，通过CCK-8和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡，并检测了与IGF-1相关的信号通路IGF-1/PI3K/Akt和IGF-1/MAPK/ERK中的关键因子AKT与ERK表达量。结果显示，转染后48-72h，miR-new14组的OD450值