BMP15和GDF9通过miRNA-375-BMPR2调控牛卵丘细胞增殖与凋亡的研究

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1、分类号：S814.8单位代码：10183研究生学号：2014881007密级：公开吉林大学博士学位论文BMP15和GDF9通过miRNA-375--BMPR2调控牛卵丘细胞增殖与凋亡的研究EffectsofBMP15andGDF9throughmiRNA-375--BMPR2pathwayonbovinecumuluscellsproliferationandapoptosis作者姓名：刘畅专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：动物繁殖生物技术指导教师：张嘉保教授培养单位：动物科学学院2018年6月BMP15和GDF9通

2、过miRNA-375--BMPR2调控牛卵丘细胞增殖与凋亡的研究EffectsofBMP15andGDF9throughmiRNA-375--BMPR2pathwayonbovinecumuluscellsproliferationandapoptosis作者姓名：刘畅专业名称：动物遗传育种与繁殖指导教师：张嘉保教授学位类别：农学博士论文答辩日期：2018年6月5日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席秦贵信教授吉林农业大学委员姜怀志教授吉林农业大学任文陟教授吉林大学李子义教授吉林大学赵志辉教授吉林

3、大学沈景林教授吉林大学李纯锦教授吉林大学I中文摘要BMP15和GDF9通过miRNA-375--BMPR2调控牛卵丘细胞增殖与凋亡的研究卵泡是哺乳动物卵巢上的基本发育单元，主要由卵母细胞及排列在周围的细胞层、卵泡膜及卵泡液组成。细胞层中的颗粒细胞又可分为壁层颗粒细胞（MGC）和卵丘细胞（CC），二者对卵泡的发育具有重要作用，而卵丘细胞作为颗粒细胞的一种，其增殖与凋亡对卵泡的发育和卵母细胞的成熟起着至关重要的作用。卵母细胞分泌的骨形态发生蛋白15（BoneMorphogeneticProtein15，BMP15，又名G

4、DF9B）和生长分化因子9（GrowthDifferentiationFactor9，GDF9）是卵泡生长发育和卵巢功能的重要调节因子，BMPR2是BMP15和GDF9唯一且共同的II型受体。目前，已知有多个miRNA可以调控BMPR2基因的表达，但均集中在干细胞或间充质干细胞的研究方面。项目组前期研究结果表明，BMPR2是miR-375的直接靶基因，抑制BMPR2的表达具有与过表达miR-375相同的细胞分化抑制作用。因此，miR-375可能具有潜在调控BMP15和GDF9相关通路的作用，但其具体作用途径和机制尚不

5、明确。基于此，本研究首先体外分离培养牛卵丘细胞，在体外培养过程中采用CCK-8法和流式细胞术，筛选培养液中BMP15和GDF9单独或联合添加浓度，明确BMP15和GDF9对牛卵丘细胞增殖与凋亡的影响。结果表明，100ng/mL的BMP15、200ng/mL的GDF9、50ng/mL的BMP15和100ng/mL的GDF9联合添加能有效抑制牛卵丘细胞凋亡、促进细胞的增殖。为探讨miR-375对BMP15与GDF9共同受体BMPR2的表达调控作用，分析miR-375在BMP15与GDF9单独或协同添加的牛卵丘细胞增殖与凋

6、亡中的关键作用，我们在添加适宜浓度BMP15、GDF9、BMP15+GDF9后，通过Stem-loopRT-qPCR检测卵丘细胞内源miR-375的表达变化，荧光定量PCR与WesternBlot分别检测BMPR2mRNA与蛋白变化。结果显示，BMP15、GDF9的添加能够引起miR-375下调，上调BMPR2表达水平，即BMP15/GDF9可负调控miR-375的表达水平，正调控BMPR2的表达水平。除II型受体外，BMP15、GDF9还可与它们各自的I型受体ALK4、ALK5、IIALK6结合，通过Smad信号通

7、路调控卵泡生长发育和颗粒细胞的生长分化。因此，本研究人工合成miR-375mimics、miR-375inhibitor和BMPR2siRNA，通过riboFECTTMCP转染试剂转染至细胞内，随后通过RT-qPCR、WesternBlot检测转染后BMP15/GDF9的I型受体ALK4、ALK5、ALK6的表达变化；通过WesternBlot检测BMP15/GDF9下游信号通路关键蛋白Smad2/3与Smad1/5/8磷酸化（p-Smad1/5/8与p-Smad2/3）水平。结果表明，miR-375可通过靶基因BM

8、PR2间接调控ALK4的表达水平，而对ALK5/6没有明显的调控作用。ALK4本身是一个促凋亡因子，miR-375的添加上调了ALK4的表达水平，这与miRNA-375本身促进细胞凋亡的功能相符。此外，BMP15、GDF9、BMP15/GDF9、miR-375、BMPR2对Smad1/5/8及Smad2/3水平均无显著调控作用，但对p-Smad