生长分化因子-9对牛卵丘细胞影响的研究

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1、内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我～同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：迭罂丝熟蝣臣、尽期：巡f堡：笸：qI{内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业太学有关保护知识产权

2、的规定，即：研究生在攻读学位期闾论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：本研究由国家自然科学基金(31060307)国家科技支撑计划(2011BADl9801)lIIIIIIIUIIIIIY2600

3、726公益性行业(农业)科研专项经费(201003061)提供资助ThiSd’issertationwassupportedbyTheNationaINaturaIScienceFoundationofchina(31060307)TheNationa{KeyTechnoIogyR&DProgram(2011BADl9801)TheSpeciaIFundforAgro-scientif；CResearchinthePubIicInterest(201003061)摘要本论文研究了重组GDF-9对牛卵丘细胞增殖及扩展相关基因表达

4、的影响。研究结果分如下4个部分：1．通过RT—PCR检测体外培养不同成熟时间的牛卵丘卵母细胞复合体中GDF-9的表达情况，同时观察卵丘扩展情况。结果表明在不同的成熟培养时间，GDF-9基因在牛卵丘卵母细胞复合体中均有表达，且在体外成熟培养12小时表达量成峰值，与卵丘细胞开始扩展的时间一致。2．将卵丘卵母细胞复合体中的卵母细胞进行去除处理，同时加入外源lOOng／mlGDF一9以及1OugFSH，观察外源GDF一9和内源的GDF一9对卵母细胞的卵丘细胞复合体在体外培养中扩展的影响。结果表明不论外源GDF一9和内源的GDF一9在卵

5、丘细胞扩展中都起着重要的作用，而且FSH对卵丘细胞的作用也需要．GDF一9的协同。3．在牛卵丘细胞体外培养的基础上，研究外源GDF-9和FSH对其生长的影响。结果表明，不论FSH存在与否，GDF一9可以促进牛卵丘细胞增殖．这种促进作用随着浓度的增加而增强。而且在相同GDF一9浓度下，FSH显著促进细胞增殖，表明GDF一9与FSH在一定程度上对卵丘细胞的增殖具有协同作用。采用实时荧光定量PCR技术研究不同浓度下外源重组6DF一9对牛卵丘细胞扩展相关基因(PTX3、HAS2、PTGS2)表达的影响，试验结果表明：扩展相关基医表达对

6、GDF-9浓度具有梯度依赖性，随着GDF一9浓度的增大，扩展相关基因表达也随着增大，表明GDF-9在卵丘细胞扩展中起到一定的作用。4．构建牛GDF一9基因真核表达质粒，在牛卵丘细胞中过表达。利用western—blot检测GDF一9在卵丘细胞中过表达情况，同时通过实时荧光定量PCR技术检测扩展相关基因表达的情况。(1)通过weste]1n—blot对牛GDF一9过表达检测结果表明，检测有单一条带，说明GDF一9真核表达质粒构建成功。(2)与对照组相比，过表达GDF一9的牛卵丘细胞中扩展相关基因的表达明显升高。本试验通过对GDF

7、一9在卵丘细胞体外增殖培养中的作用研究，表明GDF一9对卵丘细胞增殖具有重要作用，这一结-步阐明GDF-9调节卵丘细胞功能的分子机制具有重要的意义。关键词：生长分化因子9；牛卵丘细胞：扩展相关基因TheStudyonGrowthDifferentiationFactor9AffectingCumulusCellAbstractRecombinantGDF一9affectingthebovinecumuluscellsproliferationandtheexpressionoftherelategeneswereinvesti

8、gatedinthisthesis．theresultareasfollow：1．TheGDF-9expressioninthebovinecumulusoocytecomplexesatthedifferentmatureculturetimeweremeasuredbyu