基于大肠杆菌细胞膜特性研究丁香酚协同脉冲电场的灭菌机制

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1、硕士学位论文基于大肠杆菌细胞膜特性研究丁香酚协同脉冲电场的灭菌机制作者姓名王倩怡学科专业食品科学与工程指导教师曾新安教授所在学院食品科学与工程学院论文提交日期2018年5月SynergisticInactivationMechanismofPulsedElectricFieldwithEugenolBasedonCellMembraneCharacteristicsofEscherichiacoliADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：WangQianyiSupervisor：P

2、rof.ZengXin-AnSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China分类号：TS201.3学校代号：10561学号：201520120944华南理工大学硕士学位论文基于大肠杆菌细胞膜特性研究丁香酚协同脉冲电场的灭菌机制国家自然科学基金（21576099）资助项目作者姓名：王倩怡指导教师姓名、职称：曾新安教授申请学位级别：工学硕士学科专业名称：食品科学与工程研究方向：食品非热加工论文提交日期：2018年5月29日论文答辩日期：2018年5月25日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：2018

3、年6月29日答辩委员会成员：主席：张学武委员：曾新安、谢德明、高文宏、韩忠摘要作为一种新型的食品非热灭菌技术，脉冲电场具有良好的灭菌效果且能最大限度地保留食品的营养成分。一般来说，提高脉冲电场的灭菌效率可通过增加电场强度、延长处理时间与其他技术手段协同处理实现。其中增加场强和延长时间会加大能量的输入，甚至导致处理样品的温度过高，引起热效应，而与天然抗菌成分的协同处理能够增加栅栏因子，产生更好的灭菌效果。丁香酚（4-烯丙基-2-甲氧基苯酚）是精油中的一种天然成分，对多种菌株具有显著的抗菌作用，然而对其抗菌机制的研究并不完善。此外，关于丁香酚协同脉

4、冲电场灭菌的研究鲜有报道。本课题基于大肠杆菌细胞膜特性研究丁香酚协同脉冲电场的灭菌机制，具体研究内容和结果如下：1.采用气相色谱法结合拉曼光谱法，测定丁香酚（<0.5MIC）培养环境下，稳定期大肠杆菌细胞膜脂肪酸组成以及膜流动性的变化，研究细胞膜特性变化对脉冲电场灭菌效率的影响。结果发现，随着丁香酚浓度增加，大肠杆菌细胞膜不饱和脂肪酸含量升高且环状脂肪酸含量降低，细胞膜流动性增加，同时脉冲电场的灭菌效率提高，表明细胞膜流动性是决定丁香酚协同脉冲电场灭菌效率的主导因素。2.采用荧光定量PCR的方法，测定丁香酚（<0.5MIC）培养环境下，稳定期大

5、肠杆菌细胞膜脂肪酸合成基因（fabA、fabD、fabI和cfa）及rpos基因相对表达量的变化，深入阐述丁香酚协同脉冲电场对大肠杆菌的灭活机制。结果发现，随着丁香酚浓度增加，fabA基因相对表达量上调，cfa基因相对表达量下调，说明丁香酚可以调控细胞膜脂肪酸合成基因的表达水平，修饰其脂肪酸组成，使细胞膜流动性增加，进而提高脉冲电场的灭菌效率。此外，虽然丁香酚对rpos基因的相对表达量有一定的修饰作用，但该基因的调控作用对脉冲电场的灭菌效率没有直接影响。3.以丁香酚（≥0.5MIC）处理前后的大肠杆菌为对象，从细胞膜和DNA的角度研究丁香酚的抗

6、菌机制。使用丁香酚处理大肠杆菌细胞，通过测定相对电导率、蛋白质核酸泄露实验以及扫描电镜观察，发现丁香酚对大肠杆菌细胞膜造成破坏，离子稳态失衡，细胞内核酸和蛋白质大分子流出，最终导致细胞死亡。使用丁香酚处理大肠杆菌DNA，通过荧光光谱分析和原子力显微镜观察，证明丁香酚对DNA有沟槽结合作用，可以影响DNA的二级结构，甚至诱导DNA聚集。4.在不同丁香酚（≥0.5MIC）浓度和电场强度条件下研究丁香酚协同脉冲电场处理大肠杆菌的杀灭效率。结果发现，丁香酚与脉冲电场具有协同作用，并且该协同作用I随着电场强度或丁香酚浓度增加而增加。其可能的原因是：由于丁

7、香酚可以破坏细胞膜结构功能，有利于脉冲电场对细胞膜的作用并促进细胞破裂死亡；由于脉冲电场可以诱导细胞膜结构发生变化，促进丁香酚穿过细胞膜进入细胞内部并直接作用于DNA，进而产生协同效果。本文揭示了丁香酚协同脉冲电场的灭菌机制，并以此为基础提供新的协同灭菌方法。一方面可以有助于强化脉冲电场灭菌在食品工业中的应用，另一方面也为丁香酚在食品工业中的应用开辟了新的途径。关键词：脉冲电场；丁香酚；大肠杆菌；细胞膜；协同作用IIABSTRACTPulsedelectricfield(PEF)technology,anemergingnon-thermalt

8、echnique,caneffectivelyinactivatebacteriaandavoidadditionalfood-qualityloss