筛选与单克隆挑取

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1、****G418筛选原理及方法分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因

2、）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。由于每种细胞对G418的敏

3、感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。====================================================细胞系或机体        G418浓度（ug/ml）中国仓鼠卵巢细胞        700～800Madin-Darby犬肾细胞      500人上皮A431细胞        400猿CV

4、-1细胞        500盘基网柄菌属       10～35植物          10酵母          125～500====================================================由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以加药时间不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。方法：（）1.G418的配制：取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消

5、毒，4度保存。2.细胞培养：取细胞按一定密度接种于24孔板，待细胞生长状态恢复，且细胞密度小于满培养皿单层细胞数的50%时，弃去原培养液，加入含不同浓度G418（200-800μg/ml）的完全培养液，每个浓度设3个平行孔，三天一换液，继续培养2周，观察细胞死亡情况，以高于杀死全部细胞的G418最小浓度的一个梯度为筛选浓度，以筛选浓度的一半为克隆细胞维持培养的浓度。3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。4.加G418筛

6、选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定

7、最佳筛选浓度。通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。a转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。8c换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，