Lypla1在动脉粥样硬化中的作用及机制研究

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1、分类号：R54学校代码：10062密级：学号：2015601070博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：Lypla1在动脉粥样硬化中的作用及机制研究TITLEStudyontheroleandmechanismofLypla1inatherosclerosis一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：王兴华导师：李广平天津医科大学研究生院二零一八年五月分类号：R54学校代码：10062密级：学号：2015601070学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：Lyp

2、la1在动脉粥样硬化中的作用及机制研究TITLEStudyontheroleandmechanismofLypla1inatherosclerosis一级学科：临床医学二级学科：内科学心血管病论文作者：王兴华导师：李广平天津医科大学研究生院二零一八年五月天津医科大学博士学位论文中文摘要背景：急性冠脉综合征的发病率逐年上升，现已成为世界人口的主要死亡原因。冠状动脉粥样硬化斑块的形成，破裂，随之引发血栓可使管腔不完全或完全阻塞，从而引发急性心血管事件的发生。了解其的病理机制，寻找简单而有效的检测、治疗手段从而减少斑块形成或增加斑块的稳定性，具有重要的临床意义及价值

3、。目的：蛋白质棕榈酰化修饰是唯一可逆的翻译后脂质修饰形式，能增加可溶性蛋白与膜的亲和性，对蛋白质的转运、定位和功能具有重要的作用。酰基蛋白硫酯酶1(acylproteinthioesterase1,APT1,Lypla1)是去棕榈酰化修饰蛋白，可以参与多种蛋白的棕榈酰修饰。有文献报导其的抑制剂可以通过作用H-Ras的去棕榈化修饰，影响H-Ras定位，从而影响下游的信号通路并逆转H-Ras引起的肿瘤表型改变。但是，有关Lypla1对Ras功能影响的研究在心血管系统至-/-今少有报道。本研究通过ox-LDL刺激人脐静脉内皮细胞及高脂喂养apoE小鼠建立动脉粥样硬化

4、模型，以Lypla1因子为核心，一方面确定其上游调控因子miR-138，另一方面通过对Lypla1下游H-Ras棕榈化修饰和MAPK信号通路的影响进行研究，力求阐明Lypla1棕榈酰化修饰在动脉粥样硬化发生发展中的作用机制和上下游通路，为该病的诊断提供新的标志物并为精准治疗提供新的可靠靶点。方法：利用生物信息学，qRT-PCR和双荧光报告载体实验方法验证Lypla1与上游作用因子miR-138直接靶定关系，及miR-138与上游调控因子H19直接靶定关系。随后，在动脉粥样硬化的细胞模型中，通过qRT-PCR和Westernblot检测ox-LDL不同时间点刺激

5、对H19、miR-138、Lypla1、DHHC9和Ras表达的影响；而后过表达或抑制表达Lypla1后检测对下游基因H-Ras表达和定位的影响，并通过抑制表达Lypla1后检测对单核细胞粘附能力，内皮细胞脂质吞噬聚集能力及对下游炎症因子的影响；随后，通过LPC诱导HUVECs细胞，检测培养液上清微囊泡中miR-138和Lypla1的表达变化，并将微囊泡与THP-1巨噬细-/-胞共培养观察对巨噬细胞MMP-9表达的影响；最后，高脂喂养apoE小鼠建立动脉粥样硬化动物模型，验证H19,miR138及Lypla1在在体动物模型中的表达变化。I天津医科大学博士学位论

6、文结果：动脉粥样硬化细胞模型中Lypla1表达升高，而miR-138表达降低，（P<0.05），且Lypla1蛋白表达出现由胞浆转入到胞膜现象。应用生物信息学，qRT-PCR,Westernblot和双荧光报告载体实验验证了miR-138是Lypla1的上游作用因子，可以抑制Lypla1的表达，同样也验证了H19是miR-138的上游作用因子。抑制表达Lypla1后H-Ras胞膜表达降低，p-MEK和p-ERK表达降低，炎症因子MMP-9、ICAM-1和VCAM-1基因表达减少（P<0.05），巨噬细胞粘附能力减弱（P<0.05），dil-ox-LDL吞噬沉积

7、能力增加（P<0.05）。随后我们用LPC刺激HUVECs后通过超速离心搜集微囊泡，检测Lypla1的RNA和蛋白水平，发现刺激24h后Lypla1表达明显增加（P<0.05），且将微囊泡与巨噬细胞共培养后，发现巨噬细胞的MMP-9表达增加（P<0.05）。最后，在动物模型中发现高脂喂养组较正常喂养组H19,Lypla表达明显增多（P<0.05），miR-138表达减少（P<0.05）。结论：Lypla1一方面在内皮细胞内通过影响H-Ras棕榈酰化修饰及其下游MAPK通路，最终影响炎症因子的表达；另一方面其可以以微囊泡为载体离开内皮细胞，影响巨噬细胞的MMP-

8、9表达，进一步参与动脉粥样硬化的形成与