甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1、SRK的克隆与体外表达及其相互作用研究

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1、中文摘要甘蓝自交不亲和信号传导元件ARCI、SRK的克隆与体外表达及其相互作用研究蔬菜专业博士研究生牛义指导教师王小佳教授(摘要)植物的自交不亲和性(self-incompatibility，SI)在植物界中普遍存在，是植物为了防止近亲繁殖、促进物种分化、保持遗传多样性，而在长期进化过程中形成的一种复杂而完善的重要机制。它实质上是一种雌蕊识别自体花粉和异体花粉，阻止自体花粉萌发的信号传导过程，涉及从授粉到受精过程中发生的花粉和雌蕊之间的相互作用，几乎一半以上的显花植物具有自交不亲和性，涉及到70

2、多个科、250多个属。甘蓝是典型的具有孢子体型自交不亲和性的芸薹属植物，这类SI在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S基因座所控制。最近几年，对芸薹属自交不亲和性的决定性因子研究方面，取得了长足的进步。迄今为止，已分离到3类与S位点连锁的基因，分别编码SLG(s—locusglycoprotein，s位点糖蛋白)、S位点富半胱氨酸蛋ASCR(S．10cuscystein-richprotein)／SPll(s．10cusproteinll，S位点蛋白11)和SRK(S-locusreceptor

3、k．in越e，S位点受体激酶)。三个基因(观G、SRK、SCR)的相继分离与鉴定，意味着由舒K介导的自交不亲和信号传导的上游事件越来越清晰了。来自花粉中的SCR／SPII在SLG的协助下与柱头上的跨膜蛋白SRK的胞外域相互识别，当两者具有相同单倍型时，SRK发生自我磷酸化，引起细胞内信号的级联反应，最后抑制白花花粉的萌发、水合或花粉管伸长。但是，对SRK介导的细胞信号传导下游磷酸化蛋白研究相对于上游受体来说要缓慢得多。在整个信号传导途径中，ARCl是下游事件中最为感兴趣的蛋白之一，它能够与SIL

4、K相互作用，并将信号传递给下游因子。因此在自交不亲和信号传导过程，SRK与ARCl的结合与否以及复合体的存在和变化是证实这个分子过程和调控自交不亲和反应的关键。为了探索这些问题，必须首先鉴定ARCl与S眦间的相互作用，调控二者的解离与聚合，深入分析二者的作用机理，建立相互作用化控试剂的筛选平台，从而为下一步筛选．ARCl的下游因子创造条件。本研究以高度自交不亲和性甘蓝E1为材料，克隆了自交不亲和信号传导元件ARCl和两南大学博十学位论文曼曼皇曼曼曼量曼曼曼曼曼曼曼量曼皇曼皇曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼

5、曼曼曼曼鼍I11HI．,曼曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼鲁曼鼍蔓皇量曼曼鼍舅苎曼皇曼曼曼寡曼皇量曼曼曼皇曼曼曼曼鼍曼曼曼SRK基因，并进行了表达分析。体外证实了√6粼l与SRK的相互作用，建立了适用于SRK和ARcl相互作用的体外检测体系，为进一步的化学调控试剂的筛选，实现SRK-ARCl复合体聚合与解离的人为调控提供理论和技术基础。主要工作及结果总结如下：1甘蓝ARCl臂重复蛋白编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达1．1ARCl基因的克隆与序列分析采用PCR和RT-PCR技术，以甘蓝E1基因组DN

6、A和柱头总RNA为模板，扩增了ARC／的DNA和cDNA序列，经测序和序列分析表明，DNA序列无内含子存在，扩增ARC／基因的编码序列为l992bp，编码663个氨基酸残基，分子量为73．5kD。序列同源性分析表明，甘蓝El的ARC／基因(B．oleraceaE1ARC／)与羽衣甘蓝ARC／基因(B．oleraceakaleARC／，NCBI登录号：EU344909)、油菜ARC／基因(口．napusARC／，NCBI登录号：AF024625)、甘蓝20010197ARC／基因(B．olerac

7、eaARCl20010197_【188】)、甘蓝ARC／基因(丑．oleraceaARC／，NCBI登录号：AJ417335)、拟南芥中泛素蛋白连接酶(彳．thalianaPⅧJ7，NCBI登录号：NMl02674)、水芹ARC／基因(彳．thalianacressARC／，NCBI登录号：AYl50512)的同源性分别为97％、94％、93％、95％、70％和70％。作为芸薹属5个基因，B．oleraceaE1ARC／、B．oleraceakaleARC／，最oleraceaARC／20010

8、197、B．oleraceaARCl，B．napusARC／之间的碱基差异很小，而作为十字花科中不同属的两个基因B．oleraceaE1ARC／和彳．'thalianaARC／，在碱基上却存在相对较大的差异，编码的碱基差异大多数集中在ARCl的N端，说明ARCl基因存在较强的保守性，而且C端区域的保守性强于N端。在甘蓝与油菜的序列中均存在碱基的缺失，但这种缺失往往是以密码子形式的缺失，并没有引起移码突变。同源氨基酸序列进行比对显示，B．oleraceaElARC／基因编码的氨基酸序列与B．ole