甘蓝自交不亲和相关基因mod的克隆与其与arc1的fish定位分析

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1、4．2．3MOD基因延长片段R5的测序鉴定分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯294．3ARCl基因探针的克隆与测序鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。304．3．1ARCl基因探针的PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．304．3．2ARCl基因探针片段的测序鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯304．4甘蓝靶DNA载体制备技术的优化探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．324．4．1根尖前中期染色体制片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．324．4．2减数分裂早粗线期染色体制片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯374．5甘蓝不同伸长

2、长度染色体FISH技术体系的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．394．5．1FISH技术的基本实验参数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯394．5．2甘蓝FISH杂交体系技术流程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。404．6MOD与ARCl的FISH定位分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯414．6．1MOD与ARCl在甘蓝减数分裂早粗线期染色体上的FISH定位分析⋯414．6．2MOD与ARCl在甘蓝有丝分裂前中期染色体上的FISH定位分析⋯⋯425讨论与结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。455．1讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．455．1．1MOD基因的功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯455．1．2甘蓝MOD蛋白很可能通过磷酸化调节水分运转⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。455．1．3甘蓝前中期染色体制片技术探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．465．1．4甘蓝前中期染色体FISH基因定位失败的原因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯475．2结j沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。47参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4

4、9附勇乏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．，⋯⋯⋯⋯53致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55在读期间发表的学术论文及参与课题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。57中文捅耍甘蓝自交不亲和相关基因MOD的克隆及其与彻口的FISH定位研究生物化学与分子生物学专业硕士研究生吴志刚指导教师朱利泉教授杨昆老师中文摘要植物自交不亲和(self-incompatibility，S1)信号转导过程需要一系列的信号转导元件参与完成，其中ARCl与MOD发挥着极为重要

5、的作用。近年来国际前沿通过转基因及基因敲出技术，对多种Sl信号元件进行了深入的研究，然而针对这些信号元件在芸薹属植物基因组中的拷贝数及位置关系鲜有研究。本研究对我校特有甘蓝品种的MOD基因进行了克隆及序列分析，以期弄清楚MOD基因的结构以及其调控水分的方式。另外，本研究通过对两种已知的SI元件通过荧光原位杂交技术(FluorescenceInSituHybridization，FISH)将ARC／和MOD基因定位在甘蓝的前中期、中期及粗线期的染色体上，以期弄清楚两者在甘蓝基因组上的物理位置以及拷贝数等问题。整个实验过程中获得的主要研究结果如下：1．采用

6、PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以西南大学特有的甘蓝和甘蓝型油菜基因组DNA和柱头RNA为模板分别对编码MOD的gDNA和eDNA进行扩增、克隆和测序。首次分别得到长度分别为1350bp、1449bp和1477bp的3个gDNA片段和长度为867bp的1个eDNA片段，所扩增的eDNA片段包含了MOD的整个OI谭框，通过其氨基酸序列的同源性及聚类分析证明甘蓝MOD编码蛋白属于PP类水孔蛋白，是MIP家族的一员。gDNA和cDNA序列比对发现：甘蓝和甘蓝型油菜MOD的gDNA都包含3个内含子，均符合“GT-AG”剪接法则；内含子的变异高于外显

7、子编码区14．4％到17．3％；甘蓝与油菜两者在编码区部位存在53处碱基差异，但只有3处氨基酸存在差异，表明编码区的低频变异主要是无义突变；其氨基酸序列中含有4个可能的磷酸化位点，表明MOD可能以磷酸化方式调控水分的运转，从而实现芸薹属孢子体自交不亲和(self-incompatibilityofsporophyte，ssl)的分子过程。2．采用火焰干燥法制备甘蓝的FISH靶DNA载体的前中期和粗线期染色体染色体制片，并对制片程序的关键因子进行了摸索，使得前中期和粗线期染色体制片技术得到进一步的优化。对于前中期染色体制片，通过优化，恢复培养后根尖长至1

8、．4-17咖切取可获得较多的前中期分裂相；最合适的冷处理时间应控制在16h．20h之间；0．0