兰州大学基因工程基因工程酶学基础

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1、第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶限制性核酸内切酶主要来源于原核生物1968年，Dr.WernerArber,Dr.DanielNathan和Dr.HamiltonSmith博士第一次从大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶1、来源及发现Dr.WernerArber内切酶，即在核酸分子内部制造切口的酶形成5`-P和3`-OH末端2性质3功能自我保护作用细菌的限制和修饰系统（R/M体系）a限

2、制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA分子进行分解，切成小片段AABBBBBb修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割c限制修饰系统分子机理由三个连续基因位点所控制：hsdR,hsdM, hsdShsdR---限制性内切酶:能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断hsdM---限制性甲基化酶:催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应hsdS---控制两个系统的表达:协助上述两种酶识别特殊的作用位点宿主细胞内的甲基化酶将自身DNA和噬菌体DNA实施特异性保护，封闭了自身

3、限制性酶的识别位点这种限制不完全，总有少数入侵DNA会存活，得以在宿主细胞内复制，并被宿主的甲基化酶修饰，但同时，也丧失了原宿主甲基化酶标记d意义寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，广泛存在于原核细菌中。有两方面作用：保护自身DNA不受限制破坏外源DNA，使之迅速降解二限制性内切酶的命名命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：酶编码基因所在质粒；Ⅰ：发现次序)三限制性内切酶类型目前鉴定出3种不同的限制性内切酶I型限制性内切酶II型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶限制性内切酶的类型及其主要特性II型限制性内切酶的基本特性1970年，由H.O.smith和K.W.wilc

4、ox从流感嗜血菌中分离得到如HindII（1）识别位点未甲基化修饰的特异靶序列，多数呈中心对称的回文结构，由4-8个碱基组成，有些识别位点是连续的，有些则是间断的，如GANTC（2）切割位点绝大多数II类酶在其识别位点内切割DNA粘性末端（cohensiveend）连接便利DNA分子末端标记平末端补齐一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖同裂酶(isoschizomers)：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶序列同尾酶(isocaudamer)：来源不同，识别的靶序列也各不相

5、同,但都能产生相同的粘性末端由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，称之为“杂种位点”(hybridsite)。但这类杂种位点的结构，一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别影响限制性内切酶活性的因素1、DNA的纯度2、DNA的甲基化程度3、酶切反应的温度4、DNA的分子结构5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液DNA的纯度DNA的甲基化程度原核生物限制—修饰体系，对识别序列中特定核苷酸的甲基化，会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌，在选用酶时

6、应注意：所选用的限制酶对甲基化的敏感性依DNA的不同来源选择不同的限制酶反应温度大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度为37℃，但也有许多例外，如SmaI为25℃，ApaI为30℃，TaqI为65℃消化反应温度高于或低于最适反应温度，都会影响酶的活性每ugDNA用1-5U酶切1-2hDNA的分子结构某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的酶量比消化线性DNA高出20倍一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有明显的差异，可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异造成的有些特定的限制位点，只有当其它的限制位点被广泛切割时，才能被有关的核酸限制性内切酶消化少

7、数酶，如SacII对不同部位的限制位点的切割活性会有很大的差异，其中有些位点很难被切割核酸限制性内切酶的缓冲液核酸内切酶的标准缓冲液组分：MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巯基乙醇或DTT以及BSA等NaCl或Mg2＋浓度：降低酶的活性，导致识别序列特异性改变Tris-HCl:稳定反应液的pH在酶的最佳pH范围内巯基试剂：保持酶的稳定性，避免失活Na、K离子：对部分酶反应敏感，部分酶则适应较广的离子强度的变化幅度酶解反应中的星号活性星号活性（staractivity）当酶反应体系发生改变时，酶的性能甚至酶切位点发生改变的现象