《现代生物学方法论》PPT课件

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1、现代生物学方法论吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室核酸技术盛永杰核酸技术-用来研究核酸（DNA和RNA）的技术纯化定量重量上的丰度：光谱定量数量上的绝对丰度：定量PCR高通量相对丰度：DNA芯片高通量绝对丰度：序列分析基因表达（SAGE）分子量大小：凝胶电泳合成从头合成：寡聚核苷酸的合成基因扩增：PCR反应概述其他核酸技术测序基因的表达与克隆印记杂交（Southern与Northern）生物芯片荧光原位杂交启动子技术√SELEX技术√反义技术√RNAi技术√非编码RNA√核酸的生物信息学√概述一、反义技术反义技

2、术的概念反义技术的分子机制反义核酸的设计及注意事项核酶脱氧核酶1.1反义技术概述（antisensetechnology)反义技术是根据核酸杂交原理特异性抑制特定基因(mRNA)表达的一种生物技术，包括反义RNA、反义DNA、核酶以及脱氧核酶。1.1.1概念1.1.2反义技术的主要应用方向：1通过抑制基因表达活性研究特定基因在生理、病理条件下的生物学功能。2研究和开发以疾病相关基因为靶的反义药物反义药物-利用反义技术研制的药物，以特异的基因为靶，并与之特异性互补结合的一段约20个核苷酸组成的人工合成的寡核苷酸。1

3、998年FDA批准了第一个反义药物Vitravene(巨细胞病毒性视网膜炎）1.2反义技术分子机制的模型1）仅由结合介导的机制反义核酸与特定的序列结合，从而抑制该RNA与蛋白、其他核酸或其他因子的相互作用，最终影响RNA的代谢与功能。2）结合激活不稳定的机制。通过反义结合，影响RNA的稳定性、RNA加工、亚细胞定位和转运等。3）其他机制1.2.1机制1.2.2影响反义核酸生物学活性的因素：反义核酸浓度靶RNA浓度靶RNA代谢速率抑制机制的类型和效率等1.2.3反义技术需要注意的问题反义核酸的纯度反义核酸的结构靶R

4、NA结构反义核酸在组织和细胞内的转运和分布反义核酸与非核酸因子的结合及其影响不同抑制机制的作用1.2.4能够有效起抑制作用的反义核苷酸特性：DNA序列的特异性和唯一性导入细胞的高效性无非特异性结合蛋白反义寡核苷酸mRNA特异形成杂交体靶蛋白或靶mRNA水平下降反义寡核苷酸无毒性反义寡核苷酸不引起炎症反应或免疫反应1靶目标的选择尽量避免易突变区一般选择目标为起始密码子（AUG)或其附近的15-25个碱基序列，以及该靶mRNA的5’帽区，3’非翻译区2长度反义核苷酸一般是15-20bp长的单链，但是设计病毒和质粒载体

5、可用较长的或全长DNA序列。3反义核苷酸的修饰4缺陷的避免避免回文结构以形成二聚体，GC含量不能太高避免产生高毒性和非特异性，GC含量高的序列可用硫代磷酸型寡聚体。1.3反义核苷酸设计原则：1.4核酶（Ribozyme,catalyticRNA,RNAenzyme、RNAzyme）具有催化活性的RNA分子1.4.1核酶的发现1981年Cech发现四膜虫前体rRNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。1983年Altman在研究RNaseP时发现，该酶中的RNA分子单独完成前体tRNA加工

6、。1989年Cech与Altman共同获得了诺贝尔化学奖剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP组II内含子组I内含子1.4.2核酶的分类自身剪切类核酶：在自然界发现的自身剪切类核酶有锤头核酶、发夹核酶、肝炎δ病毒（HDV)核酶、VS核酶、glmS核酶和CPEB3核酶。自身剪切类核酶共同特征：1分子小，一般为35-155个核苷酸。2剪切自身或异体RNA序列中的保守位点的磷酸二酯键，相当于内切核酸酶，产物带有5’-OH和2’，3’-环状膦酸酯。3催化机制都是一般酸碱催化

7、，质子的转移是共同的。4属于金属酶，催化反应都需要二价金属离子。锤头核酶：小分子自身分裂RNA，自身分裂是顺式（cis)反应，分子间分裂是反式（trans)反应。箭头指向切割位点最小锤头核酶由三个结构域组成：1分裂结构域GUX（X可以是A、U、C但不可以为G）2催化结构域：其中有13个核苷酸是保守的2底物结合结构域二价金属阳离子（种类、离子强度）温度pH值影响锤头核酶活性的主要因素自身剪接类核酶：I类内含子、II类内含子、类-I类内含子（groupIlike-intron)-GIR1分支核酶和剪接体，以及具有3’

8、，5’-RNA连接酶活性的天然核酶I类内含子的特征：长度140-4200nt，剪接位点序列为5’U…G3’催化核心是保守的有内部的引导序列（IGS）通过转酯反应实现自身的剪接，需要辅因子II类内含子特征：最大的核酶之一，长度为400-1000nt。II类内含子不富含高度保守的序列（结构域V和结构域IV可读框除外），但是采用高度保守的二级结构，6个结构域围绕大的中心接合以特