《系统信号通路模型》PPT课件

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1、PathwayProfilingSystemContentsIntroduction12Associatedvectors3experiment4SignaltransductionresearchThePathwayProfilingSystemsprovideameanstoassesssignaltransductionpathwayactivationinvivoThesesystemsconsistofsetsofvectorsthateachcontainadistinctcis-actingenhancereleme

2、ntupstreamofareportergene1.IntroductionBroad-spectrumprofiling：SEAP（分泌型碱性磷酸酶）SystemorLuciferase（荧光素酶）SystemsSEAP2Luciferase5Luciferase3tLuciferase2PathwayprofilingsystemMoredetailsLuciferase42.SignaltransductionresearchLuciferase4Luciferase2Luciferase3SEAP2investigat

3、enuclearhormonereceptorsstudiesofPKC&calciumsignalingpathwaysstudiesofcellproliferation&differentiationstudiesofcheckpointsinthecellcyclefunctionLuciferase5studiesofcellinflammation&proliferation2.1报告基因secretedalkalinephosphatasereporter（SEAP，分泌型碱性磷酸酶报告基因）：是人胎盘碱性磷酸酶突交

4、体，具有耐热性，能分泌到细胞外，而且在L-高精氨酸(L-homoarginine)存在下活性亦不变（内源性的碱性磷酸酶会在其存在下失活）。--由于该酶能分泌到细胞外，在检测时，可以在不破坏细胞的情况下，任意时间都可以取细胞培养上清液进行重复的，动态的检测，且被检测细胞还可以用做其它的用途。是一个很有前途的报告基因。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D-荧光素-O-磷酸盐水解生成D-荧光素

5、，后者又可作为荧光素酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报告基因的检测，还可用一步化学发光法检测酶活性。Luciferasereportor(荧光素酶报告基因):荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。目前较灵敏的检测系统为双荧光素酶检测系统萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase)和海肾荧光素酶(Ranillaluciferase)催化的发光反应。2.23.AssociatedvectorscontrolGeneralizedmapofthepathwa

6、yprofilingvectorsThecis-actingenhancerelementvectorconstructsinthepathwayprofilingsystemspTAL-SEAP/Lucvectorscanbeusedtodeterminethebackgroundsignalsassociatedwiththeculturemedium.Aditionally,thesevectorscanbeusedforstudyingputativeenhancerelements,whichcanbeclonedi

7、ntotheMCS.MapofpTAL-SEAP/LucpSEAP2-ControlconstiutivelyexpressesSEAPinmostcelltypes,whichmakesitiealforestabilshingtransfectionefficiencyandoptimizingyourSEAPassaydetectionmethod4.experimentprocedureAftertransfection:itisimportanttoremoveserumfromthemeiumtoensureprope

8、rinductionofthreporterSeruminducesvarioussignalingpathwayscausinghighbackground.Aboutstimulus:performatimecoursestudybycolle