《研实验大实验》PPT课件

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1、实验二蛋白酶抑制剂的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳一.目的：1.学习和掌握蛋白酶抑制剂电泳基本原理及电泳技术。2.熟练掌握蛋白酶抑制剂电泳有关试剂配制的技术和制胶技术。二、原理：(一).聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis）:是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide，简称Acr）甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide,简称Bis）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有

2、两种：化学聚合和光聚合。化学聚合:加入催化剂过硫酸铵［（NH4）2S2O3]（即AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基，这样由于乙烯基“CH2=CH－”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用，所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。光聚合:催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照2－3小时即可完成聚合反应。聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链间纵横交错，形成三维网状结构

3、，使凝胶具有分子筛性能。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。长链上富含酰胺基团，使聚丙烯酰胺成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度（T％）和交联度（C％）决定。每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr,a)和交联剂(Bis,b)总克数称为凝胶浓度，用T％表示。凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用C%表示。改变凝胶浓度（T％）和交联度（C％），可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的

4、凝胶，以适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸相对分子质量的不同，适用的浓度也不同。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是：C=6.5－0.3T此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为1％，当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4％时，有效孔径最小，C大于或小于4％时，有效孔径均变大，C大于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6％和3％。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和

5、甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％～30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS－PAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％～20％的凝胶常用于SDS－PAGE电泳的分离胶。配称30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则

6、无毒。由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有：①可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10－9～10－12mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基－CO－NH2，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”。④由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。

7、⑥无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。(二).影响电泳迁移率的因素⒈电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm＝10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电