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1、中国和美洲大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP和ISSR分析许艳丽中国科学院 东北地理与农业生态研究所引言材料与方法结果与分析致谢Soybeancystnematode,SCN病原：HeteroderaglycinesIchinohe特点：分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多休眠体（胞囊）存活时间长---极难防治的土传病害危害:大豆主要病害一般减产5%-10%干旱地区20%-30%严重70%-80%甚至绝产引言引言大豆胞囊线虫病防治利用抗病品种轮作线虫分类鉴定对于培育抗病品种、控制其危害意义非常重大传统形态学鉴定：以形态学、解剖学特征、结合形态测量值为依据缺点：表现型特征
2、不稳定特征多样性少和形态特征测量值重叠某些特征易受环境条件的影响而造成差异需要大量线虫样品引言植物寄生线虫分子诊断和鉴定技术大豆胞囊线虫鉴定分子生物学技术随着现代生物技术的发展，分子生物技术逐步引入线虫分类、诊断和鉴定当中。上个世纪80年代以来，许多学者都在试图利用分子生物学技术和方法直接检测植物寄生线虫种间和种内群体间在遗传组成上的差异、揭示线虫发育的进化关系。以期克服形态学和生物化学方法存在的缺陷的可行途径。引言大豆胞囊线虫鉴定限制性片段长度多态性（RFLP）技术马铃薯金线虫和马铃薯线虫（Burrows）SCN4号与3号和5号（Kalinsle和Huettle）短体线虫的
3、三个种(段玉玺和刘维志)随机扩增多态性DNA（RAPD）技术广泛用于分析大豆胞囊线虫、马铃薯金线虫和马铃薯白线虫和根结线虫不同毒性和致病型群体遗传变异花生根结线虫Meloidogynearenaria、南方根结线虫M.incognita、爪哇根结线虫M.javanica、北方根结线虫M.hapla扩增片段长度多态性（AFLP）技术美国和墨西哥烟草胞囊线虫属于不同组引言大豆胞囊线虫鉴定内部简单序列重复（ISSR）技术一种新型的分子标记（1994）主要应用于植物或真菌遗传学研究和作物品种鉴定核糖体DNA（rDNA）ITS-RFLP技术稳定的鉴定线虫方法和分析遗传变异的有力工具在线
4、虫的种和亚种分类中非常有用应用：胞囊线虫属Heterodera、珍珠线虫属Nacobbus、茎线虫属Ditylenchus、根结线虫属Meloidogyne、刺线虫Belonolaimus和许多小杆线虫属等引言大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究材料与方法样品名称国家地点Hg1加拿大OntarioHg2加拿大OntarioHg3加拿大OntarioHg4阿根廷SantaFeHg5阿根廷SantaFeHg6阿根廷BuenosAiresHg7美国MissouriHg8美国IllinoisHg9美国IowaStateHg10美国SouthDakotaHg11美国Minneso
5、taHg12中国黑龙江省Hg13中国黑龙江省Hg14中国黑龙江省Hg15中国黑龙江省Hg16中国黑龙江省大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究线虫胞囊和卵的分离：土样中挑出饱满胞囊---在控温控光温室（16h光、27℃水床)大豆上繁殖材料与方法大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究线虫胞囊和卵的分离：繁殖30d后取出大豆苗高压水枪强水流冲洗收集胞囊(20和60目)压碎胞囊（100-200-500目）释放卵和J2收集到离心管中2100g离心4min提取DNA用材料与方法大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究线虫DNA提取:液氮中冰冻---砸碎引物：AB28、TW81
6、RFLP:限制性内切酶(17)AluI,HinfI,HaeIII,BamHI,HindⅡ,HindⅢ,AvaI,ClaI,EcoRI,SstI,XhoI,NcoI,SacI,MboI,AccI,RsaI和Xba。材料与方法大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究材料与方法PCR扩增（50μl）:PTC-200电泳检测：1.5%琼脂糖大豆胞囊线虫ISSR研究供试大豆胞囊线虫：美国、加拿大、阿根廷、中国大豆田间16个群体23个大豆胞囊线虫近亲系PCR扩增：（50ul）PTC-200引物:20个(单引物)电泳检测：1.5%琼脂糖材料与方法大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究
7、大豆胞囊线虫rDNA-ITS的PCR扩增结果（1060bp）结果与分析SCNrDNA-ITSPCR扩增产物PCRmarker,Hg1,Hg2,Hg3,Hg4,Hg5,Hg6,Hg7,Hg8,Hg9,Hg10,Hg11,Hg12,Hg13,Hg14,Hg15,Hg16,根结线虫，CK，PCRmarker大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究结果与分析用限制性内切酶HinfI、ClaI、Xba和EcoRI酶切大豆胞囊线虫(H.glycines)rDNA-ITSPCR扩增产物的RFPL分布图。从左至右：用
