抗菌肽CAP18的规模化表达及其表达产物的活性检测

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1、摘要摘要抗菌肽是宿主防御系统抵御外源细菌感染的一个有力武器，它们能通过直接攻击微生物的膜表面而抑制微生物的生长，是一种最具潜力的抗生素替代品。本研究的目的是通过基因优化技术，采用SOE法合成c-CAP18基因，完成抗菌肽在复合自动诱导培养基中的大规模发酵培养，并检测表达产物的体内外抑菌和抗病毒活性，为规模化生产和最终临床应用提供理论依据。根据CAP18活性片段氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏嗜性，采用SOE技术，设计合成了CAP106-142的编码基因，命名为c-CAP18，将其定向克隆至原核表达载体pET-32a的多克隆位点，获得含有1~8个片段的串联多聚体表达载体，命名为p-c-

2、CAP18Ⅰ-Ⅷ，完成了p-c-CAP18Ⅰ-Ⅷ重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。试验结果表明，在30℃、OD600菌密度1.0、IPTG浓度0.8mmol/L、诱导时间为8h的条件下，含有双拷贝的p-c-CAP18Ⅱ重组质粒能获得高水平的表达，融合蛋白表达量达到0.788g/L。为了选择适合于放大培养的培养基，使用了本研究小组发明的复合自动诱导培养基（CAI-4），进行p-c-CAP18Ⅱ的发酵培养。试验结果表明，重组质粒p-c-CAP18Ⅱ在CAI-4中获得了大量的表达，融合蛋白的表达量达到11.104g/L，与LB培养基（条件优化后）相比，表达量提高了14倍。发酵罐

3、的规模培养结果表明，可溶蛋白表达量可达到9.788g/L，占总2+可溶蛋白的62.3%。融合蛋白经Ni亲和层析后采用溴化氰对其进行化学切割，选择鸡大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、产单孢李氏杆菌(L.monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)为供试菌种，以氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素以及人工合成的CAP18106-142活性片段为阳性对照，同时设定阴性对照组，测定c-CAP18融合蛋白样品的体外抗菌活性。结果表明，培养18h后4种细菌菌密度分别为0.03525、0.0353、0.07514和0.03046，与人工合成的CA

4、P18106-142活性片段阳性对照0.02789、0.0271、0.02426和0.02968相当，而与阴性对照0.8905、0.8385、0.8和0.77差异显著（P<0.01）。选用9-11日龄SPF鸡胚15枚，随机分成3组，先通过尿囊腔接种H3N2亚型猪流感病6毒0.1mL（10EID50/枚），37℃孵育lh后，选取两组分别接种人工合成的抗菌肽CAP18和c-CAP18融合蛋白0.2mg/枚，另1组为空白对照，96h后收获病毒液，测定其血凝价。结果6.83表明，培养96小时后，c-CAP18融合蛋白组的平均病毒滴度为10，与合成多肽组（病毒6.58.125滴度10）相当，而

5、与空白对照组（病毒滴度为10）差异显著（P<0.05）同时为了检测其体内抑菌抗病毒活性，选用6-8周龄的雄性Balb/C小鼠45只，随机分为9组，每组5只，其中3组接种大肠杆菌(E.coli)，3组接种金黄色葡萄球菌(S.aureus)，接66种菌量均为2×10CFU/只，3组接种H3N2亚型猪流感病毒，接毒剂量为10EID50/只。3天后从接种大肠杆菌组和金黄色葡萄球菌组各选出2组分别经鼻腔服用卡那霉素和c-CAP18融合蛋白，均为0.2mg/只/天，另2组为阴性对照，从接种H3N2亚型猪流感病毒组选出2组，分别经鼻腔途径服用人工合成的c-CAP18活性片段和c-CAP18融合蛋白

6、，均为0.2mg/只/天，Ⅰ东北农业大学理学硕士学位论文另1组为阴性对照，连续给药3天，观察1周。1周后从每组各取2只小鼠，采集病料进行77菌落计数和病毒血凝价的测定。结果表明，两种细菌最高菌落数分别为2.41×10和1.41×10，7777与阳性对照组1.08×10和0.99×10相当，而与阴性对照组4.33×10和2.08×10差异显著4.33.64.34.64.6（P<0.05）；心、肝、脾、肺和大肠各组织病毒血凝价分别为10、10、10、10和10，3.63.33.64.34.36.66.37.38.3与合成多肽组10、10、10、10和10相当，而与阴性对照组10、10、1

7、0、107.6和10差异显著（P<0.01）。以上结果表明，本研究已经成功表达抗菌肽c-CAP18Ⅱ融合蛋白，并进行了规模化培养，纯化的重组蛋白经溴化氰切割后对供试菌毒均有抑制活性。关键词：抗菌肽；CAP18；融合表达；条件优化；纯化；活性检测ⅡAbstractLargeScaleExpressionofAntimicrobialPeptideCAP18andItsAntimicrobialActivityAnalysisAbstractAntibacte