微生物的分子生物学鉴定方法

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1、http://www.paper.edu.cn1微生物的分子生物学鉴定方法112胡雪莲，张钧，单保庆1北京理工大学生命科学与技术学院，北京（100081）2中国科学院生态研究中心环境水化学国家重点实验室，北京（100085）E-mail:zhangjun@bit.edu.cn摘要：传统的微生物分类和鉴定方法主要是以微生物的形态学和生理生化等特性为依据，繁琐且费时。近年分子生物学的发展，为微生物的分类鉴定工作提供了较简便准确的方法。分子生物学方法一部分用到PCR扩增，比如：变性和温度梯度凝胶电泳，单链构建多态性，限制性片段长度多态性，自动核糖体间隔基因分析等。一些不依赖PCR的方法也得

2、到广泛的应用，如荧光原位杂交，DNA联合分析等。本文重点综述了几种广泛应用的分子生物学技术并对其原理及优缺点进行了阐述。关键词：微生物群落，分类和鉴定，分子生物学方法近15年人们对微生物多样性进行了大量的研究，但是由于技术方法的局限，一些研究并不能深入展开。分子生物学方法的出现使人类可以在种属水平上对水生真核微生物群体的多样性进行鉴定和分类，但是对原核微生物的研究仍然很少。因为它们体积微小，表型特征多样，而且大部分原核微生物不能人工培养，因此实际上也只有0.5%～10%的原核生物被鉴定出。令人欣喜的是近年来出现的一些分子生物学方法为我们研究原核微生物开辟了新途径。在本文中，我们讨论了

3、研究水生态环境中微生物多样性的分子生物学方法，其中简要介绍PCR技术,重点介绍基于PCR技术和不依赖PCR技术的方法。1.PCR技术PCR技术的兴起是生物科学界的重要变革,它克服了原有技术的不足,使人类对微生物的研究有了大的进展，由于高度的特异性和敏感性PCR扩增技术已成为研究微生物的有力工具。随着PCR技术的成熟一些更为先进和灵敏的方法应运而生,例如:实时荧光PCR(realtime-PCR),反转录PCR(ReverseTranscription(RT)-PCR)，触减PCR(Touchdown-PCR),嵌套PCR（Nested-PCR）,最小循环数PCR(MinimumCyc

4、lesforDetectableProducts(MCDP)-PCR)等。其中实时荧光PCR（realtime-PCR）可以定量测定微生物，此方法可以检测到扩增过程中任[1]一时间反应物的变化.它可用于测定提取总DNA中靶基因的含量。如果靶基因含量较高，扩增几个循环就能检测到产物。反转录PCR（RT-PCR）中，用特殊的引物扩增可以得到大量的目的片段。RT-PCR是一种非常灵敏的扩增活性基因的方法，它还可以测出活性较大的[2]基因,并可以找到含有大量RNA的活性细胞。在触减PCR(Touchdown-PCR)技术中,退火温度在每个连续的循环中持续降低1～2℃，退火的起始温度要比Tm高

5、5～10℃,以后逐渐降低。起始扩增循环要在很严格的退火条件下进行,以后的扩增条件逐渐宽松这样可扩增出大量产[3]物。此方法可以达到最理想的扩增效果而不需耗费时间。最小循环数PCR(MCDP-PCR)技术可以找出能检测到微量产物的最少循环数，因此可以把循环数减少到最小以使反应受到的干扰也最小。基因盒PCR(geneCassette-PCR)技术靶向重组位点，因此内含子两侧的基因被[4]用于探索环境基因群中的新基因。这种方法事先不需要知道基因的序列。尽管PCR技术是检测微生物多样性的最快的方法之一，但它本身也有着局限性，比如不同DNA模板的多1本课题得到天津市科技创新专项资金项目（06F

6、ZZDSH00900）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn样化扩增，扩增对模板浓度的敏感性，对不纯DNA的扩增，嵌合序列的构建都影响PCR[5]的测定结果。2.基于PCR的分子生物学方法2.1克隆文库中的随机测序克隆文库中的随机测序(Randomsequencinginclonelibraries)，此方法的第一步是PCR产物的克隆，然后进行克隆文库的随机测序。序列分析可以鉴定出初始PCR产物中的优势拷贝，把这些序列与序列库中相似序列做比较，就可以对新序列进行鉴定或分析其与已知物种的关系，并可以通过构建系统发育树从分子序列库中推断出生物发育的关系。[6]克隆测

7、序方法首先被Giovannoni等应用于16SrDNA的定位，以对海域中浮游细菌的[7]多样性作检测。Zwart等分析了北美和欧洲处于不同生长PH值和营养条件下的微生物的16SrDNA，结果表明淡水细菌在全球都有分布。2.2变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（Denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)和温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectr