白腐菌Pleurotus+ostreatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究

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1、白腐茁Pleurotusoslrealtts漆酶及对蒽醍染料和碱木素脱色的研究摘要本论文以白腐菌木质素降解酶为研究对象，从十二株白腐菌中筛选产木质素降解酶能力强的菌株，利用层析技术将木质素降解酶分离纯化，并进一步了解该酶的基本酶学性质和特性，用于蒽醌染料SN4R的脱色研究，同时考察了产漆酶自腐菌对造纸碱木素的脱色能力。所试自腐菌在限氮条件下未发现有锰过氧化物酶和木素过氧化物酶的生成，主要产生的木质素降解酶为漆酶。其中产漆酶能力最强的是侧耳(Pleurotusostreatus324)；次之为侧耳(Pleurotus

2、ostreatusJ青岛黑，杏鲍菇(Pleurotuseryngii)，侧耳(Pleurotusoslreatus)5526；产漆酶能力较低的有香菇(Lentinusedodes9608)，以及侧耳(Pleurotusoslreatus)中的792、G1、G5和鲍鱼菇；而杂色云芝(Polyporusversicolo，)，灰管层孔(Fomeslignosus)，草菇(Votvariellavolvcea)在此条件下不产漆酶。在富氮培养条件下，未发现有木质素过氧化物酶的生成，主要木质素降解酶为漆酶和锰过氧化物酶。在富

3、氮培养条件下自腐菌产漆酶能力明显低于限氮条件下产漆酶能力，高浓度的氮对漆酶生产有抑制作用。糙皮侧耳(户leurotusostreatus324)在限氮条件下产漆酶能力较强，本论文研究了该菌的产漆酶能力，并进行了酶学性质和应用性研究。白腐菌真菌Pleurotusostreatus324最佳产漆酶条件为：静置条件下培养，温度为30℃，培养基初始pH为5，三角瓶装液量为20ml／250tal。在所有测试碳源中，纤维二糖、阿拉伯糖为最佳碳源；在氮源中，有机氮要优于无机氮，如蛋白胨、酵母膏、酒石酸铵、尿素都是漆酶生产的良好氮

4、源，当培养基C／N>IO：1即高碳低氮培养条件下，有利于漆酶的形成；产酶培养基中添加0．5mmol／L浓度的不同金属离子，其中Ca”，Cu“有助于漆酶的产生；添加诱导剂ABTS(0．5．1mM／L)对漆酶的活性影响最明显，与对照相比可提高漆酶酶活5倍，约为410U／ml。该酶产量明显高于国内外同类文献报道，白腐菌Pleurotusostreatus324是漆酶的优良生产者，具有很高的实际应用价值。白腐菌Pleurotusostreatus324漆酶，经三步层析分离，纯化为电泳级，纯化倍数为26．5倍，回收率为38．

5、3％。该漆酶单个亚基分子量为56．5kD，自然分子量为56kD。该酶在醋酸缓冲液中最适反应pH为3．5，最适反应温度为65。C，在醋酸缓冲液(pH5．0)中，反应温度低于50。C时，漆酶非常稳定；该漆酶能氧化ABTS和各种酚类化合物，尤其是对对位和邻位甲氧基取代酚的氧化能力强，羟基取代酚次之，而对氨基取代酚、阿魏酸和焦醅酚的氧化能力相对较弱；叠氮化钠对该漆酶有强烈的抑制作用。与其它真菌漆酶相比，无论是在分子量大小上，还是在酶学性质上都明显不同，可初步断定Pleurotus大连理工大学博士学位论文ostreatus3

6、24漆酶为一新的真菌漆酶。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，可催化酚类化合物和芳香胺的氧化，在小分子介体物质存在下，漆酶氧化范围可进～步扩大。蒽醌染料活性艳蓝SN4R可被该粗漆酶(30U／m1)直接脱色，脱色最佳pH值为4．0，40℃为最佳脱色温度，脱色时间为12小时，脱色率为55％，但酶活与染料脱色率不呈正比关系。经一系列SN4R脱色的对比实验，发现纯漆酶和小分子物质ABTS分别单独使用时，都不能使蒽醌染料SN4R脱色，当纯漆酶中添加小分子介体物质ABTS时，可使SN4R脱色；显然蒽醌染料SN4R不是漆酶底物，小分子还原

7、介体可介导漆酶与非酶底物染料之间的氧化作用，而使染料脱色。小分子介体物质ABTS、对一甲氧基酚、藜芦醇的添加，有助于染料脱色率的提高以及脱色时间的缩短，添加一定浓度的对一甲氧基酚或藜芦醇后，染料SN4R2小时的脱色率可达80％以上。自腐菌分泌胞外氧化酶一木素降解酶。这类氧化酶底物专一性不强，除降解木质素外还降解大量的芳香族污染物。首先观察了四种白腐菌Pieurotuseryngii，Polyporusversicolor，Pleurotusostreatus和Fomeslignosus在限氮和富氮培养基中振荡培养产

8、木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的能力，由于Pleurotusostreatus和Pleurotuseryngii产酶能力较强，用于碱木素的降解脱色效果较好，二者在限氮条件下11天对碱木素降解脱色率为65％和72％。对于Pleurotusostreatus324来说，0．69／LCa2+有助于该菌体生物量的增加，对其产酶影响不明显；lOmg／LMn2+有助