TLRTolllike+receptor4和9在肝癌和肝细胞系的表达及意义研究

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1、中山大学博士学位论文TLR(Toll—likereceptor)4和9在肝癌和肝细胞系的表达及意义研究博士研究生：刘旭东导师：李魔g教授专业：内科学中文摘要Toll—likereceptors(TLRs)在宿主对侵袭的微生物的保护中扮演一个重要角色，他们作为分子探测器来检测微生物的保守肽段而激发保护性应答。TLRs通过pathogen—associatedmolecular(PAMPS)模式识别受体，．patterns包括细菌、病毒、原虫和真菌。到目前为止，11个人类，13个鼠类TLRs已经被确认。TLRl和TLR2形成异源

2、二聚体(TLRl／TLR2)识别三酰基脂肽。TLR2和TLRI或者TLRfi一起识别不同种的PA渖S，包括革兰氏阴性杆菌的肽聚籍、脂肽、脂蛋白以及支原体脂肽和真菌的酵母聚糖，TLR3识别双链RNA。TLR4和它的细胞外组分比如胁一2和CDl4识别脂多糖(革兰氏阴性杆菌的内毒素)。TLR5识别细菌鞭毛蛋白。TLR6和TLR2联合识别双酰基脂肽。TLR7和TLR8被发现在病毒复制期间识别单链KNA。TLR9识别存在在细菌和病毒基因组中的非甲基化的CpG基序。在TLRIO和TLRll中没有发现配体．TLRs主要表达在人类免疫相关细

3、胞上．比如单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、DC细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。上皮细胞是保护微生物侵袭的第一线，因而猜想TLRs也表达在上皮细胞并且也可能通过识别微生物的保守分子从而保护机体。已经发现人类胃上皮细胞中、回肠粘膜、健康的成人结肠、呼吸道上皮细胞、人类生殖道的上皮细胞系上、人类角质细胞、原代的神经胶质细胞中文摘要表达TLRs。TLRs促效剂的免疫调节的特性用于肿瘤免疫治疗时发现，TLR的表达对于免疫系统的细胞的作用是不确定的，因此人们考虑可能与肿瘤细胞本身有关。近来的研究发现TLRs在多种肿瘤或肿瘤细胞系表达，如胃癌

4、、结肠癌细胞系DLD和LoVo、肝癌细胞系HepG2上、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、宫颈鳞状细胞癌等，并且与肿瘤的生成、演变、以及侵袭等进展有关。总而言之，TLR表达在许多非免疫细胞和组织中，特别是上皮细胞，包括来源于肿瘤的上皮细胞。尽管TLRs在不同肿瘤细胞上的特性不一样，但是他们的功能已经与肿瘤发生密切相关。TLRs的表达也许促进了上皮细胞的恶性化转变、肿瘤的生长、肿瘤的免疫逃避，并且诱导对凋亡的抵抗和药物抗性。为了阐明TLRs和肿瘤细胞在功能上的相关性，而进一步研究TLRs在不同肿瘤上的表达的特性是很重要的。

5、幽门螺杆菌(HP)在肝癌组织中被发现，它属于G一杆菌，细胞壁成份以脂多糖(LPS)为主，而LPS是孔R4的配体；HBV是引起人类肝癌的主要病原体，其基因序列中非常多的CpG序列，并且有证据表明HBVDNA在血清中是以非甲基化的形式存在，而非甲基化CpGDNA是TLR9的配体。我们假说由于TLRs的表达使这些微生物通过他们的成份对肝癌的形成和发展有影响，因此我们在细胞外研究这些受体在肝癌细胞系和肝细胞系的表达及意义。第一部分TLR4和TLR9在肝癌细胞系和肝细胞系的表达目的：研究TLR4和TLR9是否在肝细胞系和肝癌细胞系表达

6、。方法：使用RT-PCR和免疫组化染色，在基因水平和蛋白水平对肝癌细胞系HepG2、HuH7、Hep3B、Bci-7402、HepG2．2．15，及肝细胞系L-02及Changliver进行了检测。结果：在基因水平，TLR4在所有细胞系都有表达，而TLR9在HepG2、Hep3B、HuH7、L-02和Changliver中有表达。在蛋白水平，TLR4同样在所有细胞系都有表达，TLR9在L-02、Changliver及HepG2、Hep3B、HuH7细胞有表达。结论：一些肝癌细胞系和肝细胞系有表达TLR4和TLR9，与在临床标

7、本的报道一致。Ⅱ第二部分肝细胞系表达TLR9对肝细胞癌变的影响目的：研究TLR9在肝细胞系的表达是否使细胞在病原微生物的成份刺激中山大学博士学位论文下向癌细胞转变。方法：在体外研究人类正常肝细胞对与TLR9相关的病原微生物成分(CpGDNA)的增殖、抗凋亡、NF-kB活化及癌变相关的细胞因子的表达变化。结果：永生化的人类正常肝癌细胞L02细胞在CpGDNA的刺激下增殖旺盛。CpGDNA、HBVDNA、乙肝病毒表面中蛋白DNA(其基因序列中含有CpGDNA)、HepG2．2．15(HepG2细胞转染了HBV全基因)细胞上清的核

8、酸抽提物都能活化NF-kB。此外，L02细胞用AnnexinV-FITC染色发现，L-02细胞在CpGDNA刺激的情况下对TNF-Q诱导的凋亡是不敏感的。L-02细胞在CpGDNA的刺激下，甲基化转移酶一1(methyltransferase一1，DNMT一1)和Bcl-2的mRNA水平是