甘蓝型油菜EMS突变体库的构建及TILLING、EcoTILLING技术的应用研究

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1、摘要摘要突变体是某个性状发生可遗传变异或某个基因发生突变的生物体材料。早期的遗传学家和育种家们主要在小范围内筛选感兴趣的突变体，随着近年来多种生物基因组序列的测序完成，大量基因等待着人们去诠释其功能，因此小范围的获得突变体己经不能满足科研和育种的需要。所以，在后基因组时代，创建能够使突变覆盖某一生物体全基因组的突变体库成为必然。在芸苔属植物中，目前很少有大型突变体库构建的报道。此外，如何构建突变体库以及如何检测和筛选这些突变体成为困扰研究人员新的难题。TILLING(靶向诱导基因组局部突变)技术是近年来发展起来的一门反向遗传学技术，目前已经成功应用

2、于动植物功能基因组研究和作物遗传育种中。该技术主要用于针对靶基因筛选由人工诱变产生突变体库中的突变体。芥酸是芸苔属作物种子中脂肪酸重要成分，也是衡量芸苔属作物品质的重要性状之一。作为食用而进行利用的甘蓝型油菜种子中低芥酸含量是其育种的重要目标，但对于甘蓝型油菜而言，低芥酸种质资源是相当匮乏的。调查已有自然和人工培育品种种子中芥酸含量的变异，以及创建新的低芥酸种质资源对于芸苔属，尤其是甘蓝型油菜意义十分重大。本研究首先利用甘蓝型油菜半冬性品种宁油7号(Ningyou7)的一个DH系作为野生型亲本材料，通过EMS诱变剂诱变后获得了大型突变体库。该突变体

3、库利用了两种EMS诱变浓度。0．6％EMS浓度的突变体库包含M2代单株7110；0．3％EMS突变体库包含M2代单株3926。同时，还获得了这些突变体材料M2代自交种子和其对应的DNA。然后，对突变体库所有材料M2代生育期内的性状进行了调查。主要包括株型、叶片性状、开花期相关形状、育性、M3代部分种子含油量等。经过调查发现，本研究构建的突变体库中含有大量表型变异突变体。在TILLING技术平台构建实验中，首先利用甘蓝型油菜Tapidor基因组BAC文库，筛选并获得了FAEl基因对应的克隆。对筛选获得FAEl的BAC克隆进行分析，发现该基因在甘蓝型油

4、菜基因组中存在两个拷贝。然后利用本实验室构建的作图群体(TNmappingpopulation)，结合分析尉剧BAC克隆的序列信息，开发分子标记，将两个拷贝的FAEl定位在了甘蓝型油菜遗传连锁图A8和C3连锁群上；同时利用两年两点的作图群体种子芥酸数据定位了甘蓝型油菜种子中芥酸含量的QTL，发现两个拷贝的FAEl基因位于两个芥酸主效QTL的峰值处。然后，通过改进的TILLING华中农业人学2009届博士学位论文技术，在构建的甘蓝型油菜EMS突变体库中筛选了FAEl基因的突变体。在1344个M2单株中共获得了19个单株在FAEl筛选区段含有突变位点。

5、计算获得了两种不同浓度诱变产生突变体库的突变密度。对于O．3％EMS诱变浓度的单株，对应的突变密度为每单株每130．8kb含有一个突变位点；0．6％EMS诱变浓度群体，对应的突变密度为每单株每41．5kb含有一个突变位点。选取其中两个种子中芥酸变异单株进行详细遗传分析，发现这些突变体芥酸的降低均因为FAEl基因的变异。在EcoTILLING技术平台构建及芥酸变异关联分析实验中，首先收集了128份芸苔属品种，其中白菜8份、甘蓝9份、甘蓝型油菜101份。利用气相色谱分析法分析了这些不同品种种子中芥酸的含量，发现在这近130份收集品种，既有高芥酸品种，也

6、有中芥酸和低芥酸品种。然后，利用EcoTILLING技术分析了甘蓝型油菜101份品种两个拷贝FAEl的多态性，并且分析了这些多态性和高低芥酸的关联性。同时还分析了白菜、甘蓝品种中高低芥酸产生的可能原因。最后，利用EeoTILLING实验中推断出的甘蓝型油菜单倍型序列和白菜、甘蓝测序分析获得的单倍型序列对芸苔属A、C基因组间的进化关系进行了深入分析。获得了能够区分A、C基因组的标记。关键词：甘蓝型油菜，突变体库，TILLING技术，芥酸含量，FAEl，EcoTILLING技术llAbstractAmutalltis锄砌ividual，organism

7、，ornewgeneticcharacterarising0rresulting舶maIlins伽ceofmu协tion，whichisabase-pairsequencechange砒hin也eDNAofagene0rc№mosomeofanorganismresultinginthecreationofanewcharacteror打annotfo岫dinthewildtype．Withmutants，geneticresearchersaretofindtherulesofdevelopmentofo玛anisms，andbreedersar

8、etOdiscovernewgeneticresources·Inpas【，researchersmairdyfoundm