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1、2012生化实验实验安排1第一天粗胰酶提取、卵清蛋白提取第二天粗胰酶提取卵清蛋白提取第三-四天PPO提取、纯化PPO活性、蛋白浓度测定第五-七天亲和层析柱材制备、染色体、质粒DNA提取酶切、亲和层析酶切、感受态细胞制备连接、感受态细胞制备连接、亲和层析转化、SDS-PAGE、电转Western胰酶提取第一天新鲜猪胰脏1个冰浴下剥除脂肪和结缔组织粉碎胰脏加100ml巳预冷却的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取检查提取液中PH，若高于pH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持在PH2.5-3.0之间在冷室5℃左右搅拌提取18—24h第2天4层纱布
2、过滤，取滤液50m1pH2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1一2h)合并滤液，用乙酸溶液调正pH至2.5-3.0放置3—5h后，，取上清，量其总体积盐析：加固体粉状硫酸铵，至40％饱和度盐析1hr12000rpm离心10min上清液加硫酸铵，至75％饱和度盐析1hr12000rpm离心10min沉淀溶于10mlpH7.5,0.1MTris透析过夜，4℃保存卵清蛋白分离提取第一天新鲜鸡蛋两只取蛋清50ml温水浴25℃～30℃加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:2V/V）最终pH约3.5再继续搅拌30min4℃放置过夜第二天布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿
3、色清液加入4℃预冷的丙酮200ml在4℃放置2h之后，弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000rpm离心5min收集沉淀沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜第三天10000rpm离心10min,取上清液再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜第三天10000rpm离心10min,取上清液亲和层析柱材制备Sephadex-G75的活化及偶联2.5g干重的葡聚糖凝胶SephadexG一75，溶胀洗涤数次加入0.05MNal04溶液50ml，30Min，蒸馏水洗涤数次，抽干备用纯化的鸡卵粘蛋白35ml，加入活化葡聚糖
4、凝胶5％K2C03、调pH7.5—9.0，缓慢搅拌3h，随时用5％K2CO3保持pH的稳定0.27gKBH4溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系，反应5h，pH维持在6.5—7.5洗涤基因组DNA提取高温裂解（抑制DNase，促进其它分子变性，促溶）；试剂：NaCl,SDS,EDTA,Tris-HClpH7.5；试验材料：微生物菌体；检测：电泳0.5~0.6％ARGAROSE；比色50ug/mlDNA;OD260/OD280=1.8，40ug/mlRNA;OD260/OD280>1.8培养好的菌液1.5mL，离心收集菌体600ul65℃预热的细胞裂解
5、液，悬浮菌体加入60ul酚滚动混匀，65℃，30min加入600ul氯仿混匀，静置4～5min，离心取上清等体积氯仿抽提一次0.1V3MNaAc（Ph5.2）、2V乙醇，－70℃20min沉淀DNA70％酒精洗涤沉淀DNA，真空干燥沉淀溶于40-100μL无菌水质粒DNA提取细菌质粒的提取①细菌培养物的生长：选择压力LB培养基中生长到对数晚期②细菌的收获和裂解：碱变性抽提的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。pH高达12.6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋
6、共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离pH4.8的AC高盐缓冲液复性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。试剂１：SolutionⅠ50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0),高压灭菌，4℃保存２：SolutionII0.2MNaOH,1%SDS,现配现用３：SolutionIII5MKAC60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存４：3MNaACpH5.2高压灭菌，4℃保存,５：氨苄青霉素50mg/ml,６：溶菌酶７：酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)８：异丙
7、醇９：LB培养基10:TE缓冲液11:电泳试剂含氨卞（100ug/ml）的LB培养基培养菌体37℃200rpm过夜吸取1.5ml,5000rpm,1－2min离心，取沉淀预冷的100ulSolutionⅠ,充分振荡悬浮加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min,150ul预冷SolutionIII混匀,冰浴5min离心,12000rpm,,5min取上清加等体积氯仿，静置2-4min，12000g离心2-4min取上清加2体积的乙醇,1/10体积乙酸钠，-80℃,5-10min12000g离心10min取沉淀冷冻干燥悬于30μl
8、dd水1.2%Argose胶电泳鉴定PPO提取、纯化材料马铃薯（大约每小组100-200g）试剂：磷酸缓冲液
