柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究

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1、华中农业大学博士学位论文柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究姓名：丁芳申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：王国平;易干军20060601柑橘黄龙病菌分子第定及0其混合发生的几种痫毒分于柃删技术研究中文摘要柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing，HLB)是世界性柑橘生产上的毁灭性病害。易与其混合发生的几种柑橘病毒病及类似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎叶病；病原分别为Citrustristezavirus(CTV)，Citrusexocortisviro耐(CEVd)

2、，Citrustatterleafvirus(CTLV)。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV为对象，从生物学角度及分子水平上对其部分特性进行研究；目的是建立上述4种病原的高灵敏度的分子检测技术体系；在分子水平上明确其部分分子特性。另外初步探讨运用超低温技术脱除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及机理。主要获得结果如下：1．HLB病菌生物学鉴定及PCR检测体系优化。以长春花和桠柑为指示植物，部分待检材料表现了明显HLB症状。通过对影响PCR技术的各个主要因素的调整，建立了HLB病菌PCR

3、、Semi-NestedPCR及Nested-PCR检测技术；并对三种方法的检测灵敏度进行比较，结果发现Semi-NestedPCR及Nested．PCR检测灵敏度远高于常规PCR，是常规PCR的104倍。运用Nested-PCR技术在黄皮上检测出HLB病菌(CandidatusLiberobacterasiaticus)，在国内外属于首次报道．2．不同引物检测HLB病菌灵敏度比较。对基于rplA／rplK，13-operon，16SrDNA和16S／23SrDNA不同基因组序列设计的5对引物依次为fP

4、400／rP400，fP535／rP535，￡A2，rJ5，贼1／rOl2e，fol2／r23S1检测HLB病菌灵敏度进行了比较，结果发现不同引物检测灵敏度不一样，其检测灵敏度由高到低依次为：fP400／rP400>fP535／rP535>酗2／订5>fOll／rOl2c>fOl2／r23S1。3．HLB菌亚洲株系分子鉴定。HLB病菌16srDNA片段RFLP．SSCP分析及基于16SrDNA序列中国柑橘黄龙病菌属分类地位的确立，分析结果显示来自中国7省区9个代表性的分离物16SrDNA高度保守，全部属

5、于亚洲菌系(CandidatusLiberobaeterasiaticus)。HLB病菌16S／23SrDNA间区序列分析及系统进化树分析结果显示：来自中国7省区分布在不同的寄主体内、导致寄主表现不同症状的18个分离物在该区段没有发生显著变异，各分离物之间的同源性达99％以上，全部与亚洲菌系(CandidatusLiberobacterasiaticus)高度同源，而与非洲菌系(CandidatusLiberobacterafricanum)差异较大。4．HLB病菌Southernblotting检测。

6、利用a．32P．dC'l-p标记16SrDNA探针进行HLB病菌Dot，blotting检测，结果发现Dot-blotting检测灵敏度高于常规PCR而低于Semi-NestedPCR及Nested-PCR，最低检测下限为30龟总核酸。5．CTV生物学鉴定、RT-PCR检测技术的建立及来自不同寄主的21个分离物3’端、5’端分子特性分析。以墨西哥莱檬和甜橙为指示植物，待检样品表现典型的CTV致病症状。核苷酸序列多重比对分析结果显示：21个CTV分离物的5’端和3’端共4个变异区(A区，F区，CP，P20

7、)存在明显的差异。A区的核苷酸序列华中农业大学2006届博十学位论文相似性最低。为95．92％；F区的核苷酸序列相似性最高，平均可达98．01％；CP，P20区的核苷酸序列相似性分别为97．20％，96．39％。21个分离物与GenBank中9个代表性的CTV分离物相应区段的核苷酸序列平均相似性分别为84．21％，96．12％，96．25％，95．48％，说明CTV分离物之间在A，F，CP，P204个区段核苷酸序列存在较大差异。6．CEVd生物学鉴定及RT-PCR检测技术建立。以Etrog香橼为指示植物

8、，待检样品表现典型的CEVd致病症状。广东、意大利、重庆中柑所分离物全长eDNA克隆及序列分析结果发现：6个CEVd分离物核苷酸序列相互之间具有明显的差异，同源性介于95．1％．99．2％之『日J；重庆中柑所分离物ZGS-ZK与意大利分离物Italy．BL核苷酸序列同源性为98．4％，可初步划归为相近的株系；广东分离物XNM．HJ与其它3个分离物核苷酸序列同源性差异在3％左右，因此极有可能为2个不同的株系。7．CTLV生物学鉴定、RT-PC