柑橘溃疡病菌的分子鉴定及检测技术研究

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1、华中农业大学硕士学位论文柑橘溃疡病菌的分子鉴定及检测技术研究姓名：罗志萍申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：洪霓20060601华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密奄如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．研究生签名：

2、、罗冬《时间：2卯占年么月2Ⅵ学位论文作粼：、罗乐备导黼：／毵签名日期：D6年占月n日签名日期：形年占月：LI-EI注：请将本表直接袈订在学位论文的扉页和目录之闻摘要柑橘溃疡病(CitrusBacterialCankerDisease，CBCD)为一种由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonasaxonopodispv．citri，Xae)弓l起的细菌性病害，该病害对柑橘生产危害严重，世界许多国家将其列为重要检疫性病害。目前，国内外均十分重视该病原菌的鉴定和检疫检验技术研究，在包括分子生物学鉴定方法在内的多种快速检疫鉴定技术研究中取得重要进展。本研究对来源于湖北的

3、一个表现柑橘溃疡病类似症状的柑橘样品上的病原菌进行了分子鉴定，并从生物学、PCR和免疫荧光技术3个方面对柑橘溃疡病菌的快速检测技术进行了研究，取得如下研究结果：1．从表现类似柑橘溃疡病的柑橘干叶上共分离到形成4种不同菌落的细菌。分别对来源于南京的阳性对照菌株、病斑研磨液)(o及分离获得的4个菌进行PCR扩增，其中阳性对照菌株和病斑研磨液)(o均扩增出一条与预期大小一致的413bp的目标片段；而从分离到的)(4中扩增出大小为500--600bp的片段；从水稻白叶枯病菌、xl、x2和x3中未扩增出任何片段。分别对以上扩增产物进行克隆和测序，结果表明，来源于南京(NJ．XC)的对

4、照菌株和湖北病叶研磨液的克隆片段全长均为413个核苷酸，与Silva等(2002)报道的相应序列相似性分别为99％(411／413)和100％(413／413)。从分离菌)(4中扩增出的片段全长557bp，GenBankBlast(nO检索结果表明该片段与根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的一个片段高度相似，部分片段相似性为93％(484／515)。2．用浓度为103cfu／ml的柑橘溃疡病菌培养液针刺法接种7个柑橘品种离体叶片后，表现出不同的发病情况。其中福本、红肉脐、纽荷尔橙、墨西哥莱檬和枳壳发病均较快，症状明显，而粗柠檬和邓肯葡萄柚的症状

5、表现不明显，仅出现了黄褐色坏死现象。3．分别采用氯仿／异戊醇方法提取的DNA和蛋白酶K裂解液作模板进行PCR扩增，其中以提取的DNA作模板，从来自南京、四川和湖北的3个柑橘溃疡病菌株NJ．XAC、SC-XAC和HB．XAC中均扩增出了预期大小413bp的目标片段；直接用裂解液作模板在相同条件下进行PCR扩增，从NJ-XAC和SC．XAC中也扩出了目标片段，但其电泳条带相对较弱。4．用浓度为1×10Jcfu／ml的菌液经涂片、BSA封闭、抗体结合和荧光显微观察，结果显示，30℃下用BSA封闭2h，30℃下抗体结合lh，荧光抗体浓度为4ug／ml，室温放40min后镜检，就可以

6、在荧光显微镜下清晰地观察到柑橘溃疡病菌菌体发出绿色荧光。关键词：柑橘溃疡病菌PCR致病性试验免疫荧光柑橘AbstractCitrusbacterialcankerdisease(CBCD)，causedbyXanthomonasaxonopodispv．cirriVauterineta1．isaseriousdiseaseofmostcitrusspeciesandeultivars．Thepathogenehavebeenappearedinlistsofquarantinepestsinmanycontries．Untilnowmuchattentionwaspayed

7、tothestudiesondetectionandinspection，andgreatprogresseshavebeenmade．Inthisstudy，asampleshowingCBCDsymptomsWascollectedfromHubeiandtheXanthomonasaxonopodispv．citriWasidentificatedbasedonitsmolecularinformation．Biologicalindexing，PCRbasedonapairofprimerscorrespo