东海区野生优质鱼种质细胞超低温冷冻保存技术的研究

《东海区野生优质鱼种质细胞超低温冷冻保存技术的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号——UDC一密级——编号——浙江大学普陀海洋高科技园区博士后研究工作报告东海区野生优质鱼种质细胞超低温冷冻保存技术的研究王阳光工作完成日期：2QQ5：lQ提交报告日期；2QQ互：jl东海区野生优质鱼种质细胞超低温冷冻保存技术的研究摘要鱼类精子超低温冷冻保存研究己经在上百种鱼获得成功。但是，在数万种鱼当中，这只是其中极小的一部分。另外，目前鱼类精子冷冻保存所报道的方式方法多种多样，迫切需要建立比较规范的、相对统一的技术路线。本文对失黄鱼和鲈鱼精子的生理特性及其冷冻保存技术进行了系统的研究，得到了在

2、液氮f—l96℃)条件下的适宜保存条件，建立了其精予超低温冷冻保存的简便易行、效果优良、便于实际应用的技术方案。大黄鱼精液的DH值为7左右，精子密度为2．22x10“。个／Ⅲ1。在4℃下，精子离体3h后还有85％活力，而在25℃下，】h后只有70％。在精子激活液中，不同的盐度和pH值时精子妁活力乖寿命影响：糖子在pH为4一lo都有活力，最适宜的p{{值为7，精子被激活最适宜盐度为3％。在各种不同配方中，经过试验优化筛选出比较理想的冷冻保护稀释液。1号(A】sever‘s)营养稀释液配方对精子的冷冻保存

3、效果较佳，精子激烈运动活力达到90％左右，精液与营齐稀释液适宜比例为1：3；抗冻剂以l5％^FGP和l0％丙三醇的效果好，精子的活力都达到90％左右，激烈运动时间和寿命最长，分别为505±44s、690±29s和485±45s、630±4ls，但经过半年保存之后，l5％AFGP的好于1O％丙三醇的，仍有90％活力左右，而乙二醇、丙二醇和二甲亚砜对精子保存效果则差。冻存方法采用先在一40℃先平衡15min，置于液氮上空3min，再浸入液氮为好；解冻采用室温自然方法，并且在3min内完成酌工艺较好。以AF

4、GP或甘油作为抗冻荆，受精率和孵化率分别为：72．3±5．8％、50．7±6．O％和65．6±6．6％、70．4±6．3％，^FGP处理的与鲜精的基本一致，而甘油处理的明显低于其它两者，表明精子受到损伤。通过电镜观察，不添加抗冻剂的精f1后仍有5(}％活力。在精子激活液中，不同的盐度和pl{值对精子的活力和寿命影响：精子在邮为4—1o都有活力，最适宜的p11值为7—8，精子被激活最适宜盐度为3％。以2号(c()rtjal珀)和4号(M叭Ⅲib’s)营养稀释液配方对精子的冷冻保存效果较佳，精子激烈运动活

5、力达到85％左右，精液与营养稀释液适宜比例为1：3；抗冻剂以l5％乙二醇的效果好，精子的活力都达到85％左右，激烈运动时间和寿命最长，分别为475±42s和615±39s；而丙三醇和AFGP对精子保存效果则很差，精子活力都不超过65％。采用先在一2o℃先平衡15min，置于液氮上空3min，再浸入液氮的冻存方法和室温解冻，并且在3min内完成的工艺较好。在大黄鱼胚胎冷冻方面，逐个筛选了方案中各个因素的最佳水平。首先研究营养稀释液配方对·心跳期胚胎在一30℃低温保存的影响，以2号((：ortlandsJ

6、营养稀释液的冷冻保存效果较好，孵化率为68．4％±6．2％，其次为1(Alsevers)，4(Mounib。s)，5(Erdahl＆Grahams)号，效果最差为3号(stoss＆Holtz’s)，孵化率仅为23．4％±11．3％；优化筛选低毒高效的冷冻保护剂，以1o％1，2一丙二醇+lo％AFGP抗冻剂的效果最好，孵化率达到67．5％±6．4％，其次为l0％乙二醇+10％AFGP，而不同浓度的丙三醇和二甲亚砜均对胚胎保存效果很差；比较发不同冻存方法对胚胎保存的影响，发现采用先在一40℃冷冻液中平衡1

7、5mjll，置于液氮上空3min，再浸入液氮，胚胎形态完整率达到90．3％±7．5％，在一20℃的效果也较好，为8O．4％±】1．6％，但一60℃的效果差，仅有20％左右，另外在0—4℃平衡30min，置于液氮上空3lnln，再浸入液氮，其胚胎形态完整率也有70．5％±8．O％，但直接投入液氮，其胚胎形态完整率为O；解冻采用水浴38—40℃快速解冻为好，胚胎解冻之后采用梯度式洗脱效果较好，即先0．5mul／L蔗糖溶液中洗脱5分钟，然后0．25mol／L蔗糖溶液中洗脱5分钟，再海水孵化，其成活率迭到68

8、。4％。关键词：大黄鱼，鲈鱼，精子，胚胎，生理特性，冷冻，抗冻荆，营养稀释液第一章综述我国有着丰富的海洋生物资源，然而，由于渔业资源的过度捕捞，无序利用，海洋生态环境也：l!j二rl益恶化，造成某些资源的衰退和濒临灭绝。另一方面，由于忽视鱼类种质保护及品种选育的工作，养殖鱼类近亲交配越来越严重，造成野生种资源的衰减退化，遗传多样性减少，生长速度减缓，加之海水养殖缺乏科学、系统的管理以及防治病害的有效措施，不仅养殖品种的种质在逐年退化。如不及时采取保护措麓