百合病毒病发病因素与病毒检测方法的研究

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1、甘肃农业大学硕士学位论文百合病毒病发病因素与病毒检测方法的研究姓名：梁巧兰申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：徐秉良20040601甘市农监大学硬士学位论文摘要百合病毒病是为害百合的主要病害之一，已报道有14种病毒可侵染百合。本研究通过血清学技术、电镜技术、田间调查对侵染我省百合的主要病毒种类、病毒粒子形态、寄主组织病理学变化的超微结构、百合病毒病的症状类型及病株在田间的分布型进行了系统研究，制备了黄瓜花叶病毒一百合株系(CMV--Li)的抗血清，建立了该病毒检测的酶联免疫吸附测试法(ELISA)体系，为百合病毒病的田问检测奠定了基础。现将研究结果总结如下：1．ELISA和电镜检

2、测结果表明，我省百合主要受黄瓜花叶病毒(CMV--Li)和百合无症病毒(LSV)的侵染，并且两种病毒存在复合侵染现象。CMV--Li和LSV侵染率分别为40％和80％，复合侵染率为40％。寄主范围试验表明，侵染百合的病毒寄主范围较窄，如CMV--Li不能侵染CMV的常规鉴别寄主普通烟、一C,Ⅱi-烟和苋色藜，但可侵染黄瓜、蔓陀罗、菜豆(美国)，产生明脉、花叶、皱缩等症状，接种发病的菜豆(美国)和黄瓜经ELISA检测，结果表明以菜豆(美国)和黄瓜为鉴别寄主，可以将CMV和LSV分开。2．对百合病汁液和组织切片电镜观察发现球状、短线状、长线状、短杆状四种病毒粒子和晶体状、风轮状、束状、卷筒状

3、、正六边形五种内含体，结合ELISA检测结果和病毒粒子的形态、大小，将球状粒子(29．5rim)确定为侵染百合的黄瓜花叶病毒，短线状病毒粒子(593．29--639．97×12．15—14．12rim)确定为百合无症病毒，另外根据内含体形态和病毒粒子大小，将长线状病毒粒子(757．58--846．25×12．12—12．75nm)和短杆状病毒粒子(500--807．69×153．85—192．31rim)确定为马铃薯Y病毒和烟草脆裂病毒。经电镜对寄主组织病理学变化观察发现，病毒侵染使细胞膜突起形成较大的膜状体和髓鞘状结构，并伟人液胞中；细胞质中形成许多小泡状体；叶绿体中淀粉粒肿大，基粒片

4、层结构疏松、病毒基质存在于叶绿体中，叶绿体趋于解体，线粒体数量增多等。对症状表现为花叶的不同病级百合样品的叶绿素含量测定表明，重花叶、轻花叶、斑驳花叶的叶绿索总量明显低于健康叶片。3．通过田间调查发现我省百合普遍受到病毒的侵染，症状表现复杂多样，主要有轻花叶型、重花叶型、矮化型、丛簇矮化型、黄化矮化型、扁茎簇叶型和花变叶型7种类型，其中轻花叶型和重花叶型发生普遍，平均发生率分别为43．62％和39．5％，其它类型出现较少。百合病毒病的发生程度与种球的种龄、品种、立地条件及前茬作物均有很大的关系。病害发生的轻重与种球种龄有关，种龄越大，发病越重；前茬种植百合的地块较甘意农监大学硕士学位论文

5、种植小麦的地块发病重；低洼积水地较高燥地发病重：不同百合品种对百合病毒的抗病性不同。4．百合病毒病病株田间分布型在发病初期以聚集分布为主；发病后期以均匀分布为主，病株在田问分布的基本成分为个体群，有明显的发病中心。理论抽样数量的大小决定于田间病株率的高低，当病株率在8．35—96．60％之间，实际抽样数量为1000、2000、3000株时，其理论抽样数在558—906、774～1655、888—2286株之间。抽样方法比较试验结果表明平行线抽样法更适合百合病毒病病株田问调查。5．将采自百合田的CMV--Li用特定寄主菜豆(美国)纯化增殖，分离提纯。提纯的CMV-Li粒子经电镜观察，紫外扫

6、描证弱为典型的CMV--Li粒子。然后焉纯化的CMV--Li免疫兔子制备抗血清。cMv—Li抗血清效价为1024；商品CMV．Li抗血清和自制抗血清对5个百合样品的ELISA检测结果一致。采用间接ELISA法对阴、阳性对照材料进行了选择，并确定了阴、阳性反应的临界值。用硫酸铵沉淀法提纯IgG，制备了辣根过氧化物酶标抗体和碱性磷酸酶标抗体，建立了酶联免疫检测系统(EusA—CMV．Li)，并对其所要求的各种指标作了合理选择。结果表明，最适包被抗体和酶标抗体的浓度分别为5pg／ml和20ug／ml，cMV—Li检测的有效稀释倍数为1：32。制作了采用培G一瑚冲和培G—AP两种酶标抗体的对黄瓜

7、花叶病毒百合株系(CMV—n)ELISA检测的标准曲线，DAS—ELISA、间接-ELISA和DIBA．ELIsA灵敏度比较试验结果表明，DAS．ELISA检测的灵敏度较高，是间接一ELISA和DIDA—ELISA灵敏度的4倍。间接一ELISA和DIBA—ELISA的检测谱比DSA—ELISA宽，对21个百合样品的CMV检测结果表明，DIBA-ELISA的检出率为66．67％，间接一ELISA的检出率为38．09％，分别比DAS—E