手足口病病毒分离方法的研究

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1、第三届佳染病防控基础研究与应且技苤论坛278polymerasereaction(realtimeRT～PCR)forEV，Enterovirus71(Enterovirus71，EV71)andCoxsackivirusl6(CAl6)．Results：HumanRD～AcellsarehighlysusceptibletoEV71，CAl6andotherenterovirus．Whensamplesweretakenwithin72hoursfromthemomentssymptomsoccurred，thevirusisolationratecouldbe66．7％，over

2、72hours，itwasonly29．1％．UsingtheVancomycin，AmikinandNystatinduringvirusesinoculation，thecontaminationratereducedfrom75％to3．93％，andtheisolationrateincreasedfrom13．6％to54．9％．Conclusions：TheVirusesiSOlationratecouldbegreatlyincreasedifthesamplesweretakenintime，littlecontaminationoccurredandeelldens

3、itywasproperly．[Keywordslttand，footandmouthdisease：Virusesisolation：CPE(cytopathiceffect)手足口病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童。以柯萨奇A组16型(Coxsackivirusl6，CAl6)和肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)：为主要病原体，己在世界范围内引起多次暴发与流行，但是CAl6引起的症状轻微，而EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎(asepicmeningitis)、脑炎(encephalitis)和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病(p

4、oliomyelitis·likeparalysis)等多种与神经系统相关的疾病，易发生死亡。EV71可导致大范围的暴发流行，伴有严重的中枢神经系统并发症或致死性肺水肿。2008年我国共报告手足口病例488955例，其中重症1165例，死亡126例，重症病例和死亡病例均以EV71为主，近两年仍呈上升趋势(1，2)。因此，在日常检测工作中，有效的分离手足口病病原体，进而进行病毒分型、基因序列的比对分析、流行趋势的变化和病毒生物学特性的研究，对手足口病的致病机理研究、诊断和预防等有着至关重要的基础作用。在手足口病原体的鉴定和分离过程中，我们主要分为EV71，CAl6和非EV71、非CAl

5、6的其他肠道病毒三个类型。在分离培养的过程中，我们发现一些问题，从而在方法学上进行了分析和比对，结果如下。1材料与方法1．1材料第三届佳染病防控基础研究与应用技苤论坛1．1．1细胞及样本RD-A细胞由中国疾病预防控制中心病毒预防控制所提供，样本取自深圳市儿童医院防保科，样本的采集方法、储存、运送、处理均按照卫生部《手足口病预防控制指南(2008年版)》(3)执行。1．1．2主要试剂：DMEM、胎牛血清、胰酶、双抗(青霉素+链霉素，i00X)及PBS购自英韦创津生物科技有限公司，病毒RNA提取试剂盒购自罗氏生物有限公司，EV71、CAl6及肠道病毒通用荧光定量RT—PCR试剂盒购自深圳

6、市太太基因生物工程有限公司，其余试剂均为进口或国产分析纯。1．2方法1．2．1样本的处理取绿豆大小的粪便样本，或肛拭子悬液lOOul于5m1离心管，加入含1096双抗的HBsS缓冲液3ml中，加入玻璃珠和0．5ml的氯仿，振荡混匀20分钟，室温3000rpm离心10min，取上清200ul加入24孔板细胞上。1．2．2抗生素的制备阿米卡星(Amikin)用灭过菌的超纯水溶解至终浓度为5×104ug／ml，标注为2500×母液。制霉菌素(Nystatin)溶解至终浓度为10000u／ml，标注为500X母液，万古霉素(Vancomycin)溶解至终浓度为5×104ug／m，标注为100

7、0X母液，一20℃保存。使用时，每50mi的细胞维持液加入Amikin20ul，NystatinlOOul，VancomycinSOul，即可使用。1．2．3细胞的处理分离病毒前12—24小时传细胞，约8X104的细胞／孔传至24孔板中。加入样本分离液之前，将细胞培养液(10％胎牛血清的DMEM)换为800ul／孑L的细胞维持液(2％胎牛血清的DMEM)。1。2．4病毒的传代及鉴定病毒培养7天，每天观察细胞病变情况，7天后冻融3次，离心3000rpm，10