《半薄超薄切片技术》PPT课件

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1、半薄/超薄切片技术背景：肉眼光学显微镜透射电镜分辨率0.2mm0.2µm0.2nm应用范围可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000)可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）观察半薄切片观察超薄切片半薄切片超薄切片？一、超薄切片技术介绍固定地好渗透包埋地好切地好载网膜做地好染地好超薄切片的基本要求:超薄切片主要步骤★取材★固定★漂洗、脱水★渗透、包埋★超薄切片★超薄切片染色每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败1取材1.1取材的基本要求(1)动作

2、迅速，取材后快速放入固定液中；(2)体积要小，一般1㎜3，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（1×1×2）mm大小长条形，之后再进行分割。(3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。(4)低温操作，最好在低温(0℃～4℃)下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。(5)取材部位要准确。1.2取材方法材料放在洁净的韧性较大的纸上滴上预冷的固定液用刀片将组织切下并修小用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。2固定(抽气)2.1固

3、定的目的︾采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。︾目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，牢固地固定在它们原来所在的位置上，不发生位移。︾良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。2.2常用固定剂(1)四氧化锇(OsO4)--OSMIUMTETRAOXIDE※强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白；※固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原；※具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好；▼酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定；▼与乙醇/醛类反应生产沉

4、淀－－漂洗●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25㎜；●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难；●锇酸固定液常用浓度：1％－2％;极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!(2)戊二醛( C5H8O2)--glutaraldehyde※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好；※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等；※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究；※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度:0.5~

5、1mm,0－4℃可长时间固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材;▼缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。(3)甲醛-Formaldehyde※渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好；※细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛；▼缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失；＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固定液。(4)高锰酸钾※强氧化剂，较好固定脂蛋白;※对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂；※只用于某些常用

6、固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.3漂洗、脱水3.1漂洗漂洗的目的:☆组织固定后脱水前的漂洗:清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察.☆双重固定中,在锇酸固定前的漂洗:避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构.常用缓冲液优点缺点pH磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用,缓冲能力强固定时易产生沉淀,易长细菌植物材料一般6.8~7.2二甲砷酸盐缓冲液不易长细菌,与低浓度钙质1-3mM不发生沉淀反应有毒(通风橱)醋酸－巴比妥缓冲液固定时不产生沉淀易长细菌,只适于配锇酸

7、固定液,不适合配醛类(缓冲失效)3.2脱水目的将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。方法用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。注意事项脱水梯度逐级进行,急剧脱水会引起细胞收缩。（30%→50%→70%→80%→95%→100%→100%）;更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透；脱水过程中应在70%脱水剂中4℃停留或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难;置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蜡）。4渗透和

8、包埋、聚合4.1渗透渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程。包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进行超薄切片。4.2包埋、聚合包埋操作：将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中，一